背景和目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是目前最常见的痴呆类型,是以进行性认知功能障碍为特征的神经性退行性疾病。AD发病机制复杂,具体病因尚未明确,并且缺少有效的干预和治疗措施。目前接受度最为广泛的β-淀粉样蛋白（Amyloid-beta,Aβ）级联学说认为,Aβ的产生和清除之间的不平衡引起Aβ聚集,引发一系列继发病理症状,最终造成认知损害和死亡。占AD病例99%的散发型AD主要由Aβ清除障碍导致,因此促进Aβ的清除仍是目前AD主要的干预策略。免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统。免疫系统具有识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调,共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。免疫系统在AD发生发展中具有重要作用,包括固有性免疫Aβ的吞噬清除作用,适应性免疫产生自身抗体等。而免疫衰老和AD的风险基因突变可以造成造血干细胞的损伤和缺陷,从而产生功能低下的外周免疫细胞,造成免疫系统的功能障碍,导致Aβ外周清除能力的下降,有可能是AD发生的重要原因之一。因此我们设想,逆转免疫细胞衰老并纠正其基因突变导致的免疫细胞功能缺陷,有可能是AD有效的干预方法和策略。骨髓移植是血液系统和免疫性疾病的主要干预手段,通过骨髓移植可以产生具有正常功能的血细胞从而重建外周血液系统。因此,我们设想通过年青骨髓移植,逆转免疫细胞衰老,并且移植年青且正常的骨髓,纠正免疫细胞风险基因变异从而重建老龄阿尔茨海默病模型小鼠的外周免疫系统,产生包括具有正常Aβ吞噬功能的单核细胞在内的免疫细胞,并探讨其对外周Aβ清除能力及对脑内Aβ沉积,AD相关病理症状和脑内环境以及认知能力的影响。在大脑中,小胶质细胞是大脑中固有免疫的重要组成部分,是维持中枢系统稳态的重要细胞,也是脑内清除Aβ的主要途径,小胶质细胞衰老导致Aβ吞噬能力障碍是AD发生发展的重要原因之一。然而在AD发生过程中,小胶质细胞Aβ吞噬功能障碍的机制尚不完全清楚,且缺少小胶质细胞衰老及功能损伤的有效生物标志物。小胶质细胞表面唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素（Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin,Siglecs）家族成员中CD22分子可抑制小胶质细胞免疫功能,衰老的小胶质细胞CD22水平明显上升。新进研究表明抑制CD22可以显著提高小胶质细胞的吞噬功能。CD22胞外段区域可以切割形成可溶性CD22（Soluble CD22,s CD22）。因此血液中s CD22水平可能与AD病程存在相关性。因此我们探讨了重庆衰老与痴呆研究（Chongqing Ageing＆Dementia Study,CADS）和澳大利亚成像,生物标记物和生活方式研究（Australian Imaging,Biomarkers and Lifestyle study,ABIL）两个人群AD患者血浆中s CD22水平的变化,并分析其认知能力下降的关系以及探讨s CD22作为小胶质细胞功能障碍潜在生物标志物的可能性。材料和方法:研究一:骨髓移植动物模型建立及验证1.实验动物分组:2月龄AD小鼠骨髓移植到9月龄AD小鼠（YTg BMCs→OTg）;9月龄AD小鼠骨髓移植到9月龄AD小鼠（OTg BMCs→OTg）;2月龄Wt CD45.1小鼠骨髓移植到9月龄AD小鼠（YWt CD45.1 BMCs→OTg）;9月龄Wt CD45.1小鼠骨髓移植到9月龄AD小鼠（OWt CD45.1 BMCs→OTg）;9月龄对照AD小鼠（Control OTg）。2.骨髓移植模型建立及嵌合率检测:将受体小鼠进行头部保护,接受8Gy 60Co辐射源辐照后,利用尾静脉注射方式接受相应来源骨髓细胞移植。骨髓移植2.5月后,对Wt CD45.1移植两组小鼠利用细胞流式检测小鼠外周血血细胞表达CD45.1比例以计算骨髓移植嵌合率及小鼠骨髓重建情况。研究二:AD年青骨髓移植和对照小鼠外周血单细胞测序检测基因表达变化,并检测外周血单核细胞吞噬功能1.对年青AD骨髓移植组（YTg BMCs→OTg）、年青（2月）对照AD小鼠（Control YTg）和老龄（12月）AD对照小鼠（Control OTg）的外周血单个核细胞进行单细胞测序,以检测年青骨髓移植后免疫细胞后基因表达变化,通过与年青和老年AD对照小鼠对比,检测骨髓移植是否使免疫细胞基因表达年轻化,筛选可以逆转因衰老而调整表达的基因,并对筛选的差异基因进行功能富集分析;对单核细胞吞噬相关基因表达量进行检测。2.分别对2、6、9、12月龄的AD和Wt小鼠采用内眦静脉取血方式取外周血,并分离单个核细胞,并采用体外FITC标记Aβ共同孵育方式,利用PE-Anti CD115、APC-Anti CD11b抗体双选单核细胞,流式细胞仪检测双选单核细胞内AβFITC平均荧光强度。分别比较小鼠外周血单核细胞Aβ吞噬能力在衰老过程中的变化。3.采用相同方式,分别对4组移植小鼠采取相同方式进行检测,以检测接受不同月龄和来源骨髓移植后,受体小鼠外周血单核细胞Aβ吞噬能力。研究三:年青AD小鼠骨髓移植对老龄AD小鼠脑内Aβ沉积、AD相关病理及认知能力改善作用1.行为学检测:对YTg BMCs→OTg,OTg BMCs→OTg,Control OTg 3组小鼠进行旷场实验和Y迷宫测试。分别记录小鼠在旷场中的贴壁次数;Y迷宫新臂学习中进入新臂的时间比和次数比;以及Y迷宫轮替实验中的轮替率。2.免疫组化检测:利用免疫组化对3组小鼠脑片进行染色。分别使用6E10抗体,和刚果红对小鼠脑内总斑块和致密斑块进行染色;使用CD68抗体对小鼠脑内活化小胶质细胞进行染色;使用Neu N、Caspase-3、Map-2抗体分别对小鼠脑内神经元、神经细胞凋亡以及轴突进行免疫荧光检测。3.蛋白免疫印迹检测:分别3组对小鼠脑匀浆进行APP相关代谢产物、剪切酶、Aβ转运酶、降解酶进行检测。4.ELISA检测:对3组小鼠血浆中Aβ含量,脑组织Tris盐酸缓冲液（Tris-base buffer solution,TBS）、十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）和甲酸（Formic Acid,FA）提取液中的可溶性、疏松性和难溶性斑块Aβ含量以及脑匀浆RIPA提取液中的炎性因子含量进行检测。研究四:年青Wt CD45.1小鼠骨髓移植对老龄AD小鼠脑内Aβ沉积、AD相关病理及认知能力改善作用1.行为学检测:对YWt CD45.1 BMCs→OTg,OWt CD45.1 BMCs→OTg 2组小鼠进行旷场实验和Y迷宫测试。分别记录小鼠在旷场中的贴壁次数;Y迷宫新臂学习中进入新臂的时间比和次数比;以及Y迷宫轮替实验中的轮替率。2.免疫组化检测:利用免疫组化对2组小鼠脑片进行染色。分别使用6E10抗体,和刚果红对小鼠脑内疏松和致密斑块进行染色;并对不同骨髓来源移植小鼠脑内Aβ沉积水平进行比较;使用CD68抗体对小鼠脑内活化小胶质细胞进行染色;使用Neu N、Caspase-3、Map-2抗体分别对小鼠脑内神经元、神经细胞凋亡以及轴突进行免疫荧光检测。3.蛋白免疫印迹检测:分别2组对小鼠脑匀浆进行APP相关代谢产物、剪切酶、Aβ转运酶、降解酶,神经元含量进行检测。4.ELISA检测:对2组小鼠血浆中Aβ含量,TBS、SDS和FA提取液中的可溶性、疏松性和难溶性斑块Aβ含量以及脑匀浆RIPA提取液中的炎性因子含量进行检测。研究五:血浆可溶性CD22水平在AD人群中变化以及其与阿尔茨海默病认知功能下降的相关性研究纳入陆军军医大学大坪医院就诊的AD患者和认知功能正常者158例,包括46例PET检测阳性的AD患者作为痴呆期AD组,以及接受腰麻手术的112名年龄匹配的认知正常的参与者。在112名认知正常者中,脑脊液AD核心生物标志物正常的66例参与者作为认知正常对照组,46例脑脊液AD核心生物标志物异常参与者作为临床前期AD组。纳入AIBL研究中339例参与者,其中28例PET检测阳性的AD患者作为痴呆期AD组,173例PET检测阳性但认知功能正常者作为临床前期AD组,138例PET阴性认知功能正常者作为认知正常对照组,分别检测患者血浆中s CD22水平,并与脑脊液AD生物标志物、脑内Aβ沉积水平以及认知功能基线水平和下降率进行相关性分析。结果:研究一:建立骨髓移植模型2.5月后对Wt CD45.1组移植小鼠进行嵌合率检测,结果显示,骨髓移植嵌合率均在85%以上,骨髓移植动物模型建立成功。并且YWt CD45.1BMCs→OTg组嵌合率显著高于OWt CD45.1 BMCs→OTg组。研究二:接受年青AD骨髓移植后,小鼠外周血液免疫细胞基因表达与老龄对照AD小鼠有明显差异,而与年青对照AD小鼠更为接近;B、T、单核细胞部分因衰老而调整表达的基因,因年青骨髓移植而得到逆转;功能富集分析显示逆转基因主要与AD等退行性疾病相关。在年青对照AD小鼠和年青AD骨髓移植小鼠单核细胞吞噬相关基因表达增加。在AD小鼠和Wt小鼠中,其外周血单核细胞Aβ吞噬能力随月龄增加而显著下降;接受年青骨髓移植小鼠,单核细胞吞噬能力显著高于接受老龄骨髓移植小鼠以及空白对照小鼠。研究三:与接受老龄9月龄AD骨髓移植小鼠和空白对照老龄AD小鼠相比,接受年青2月龄AD骨髓移植的小鼠,血浆中Aβ含量明显降低,脑内Aβ沉积量显著下降,脑内活化小胶质细胞明显减少,炎性环境明显改善,并且显著提高小鼠行为认知功能。研究四:与接受老龄9月龄Wt CD45.1骨髓移植小鼠相比,接受年青2月龄Wt CD45.1骨髓移植的小鼠,血浆中Aβ含量明显降低,脑内Aβ沉积量显著下降,脑内活化小胶质细胞明显减少,炎性环境明显改善,并且显著提高小鼠行为认知功能。与接受老龄9月龄AD骨髓移植小鼠相比,接受老龄9月龄Wt CD45.1骨髓移植小鼠脑内Aβ沉积降低。研究五:AD痴呆患者和临床前期AD患者相比于认知功能正常对照者血浆s CD22水平明显升高,痴呆期AD患者水平进一步升高,APOEε4携带者s CD22水平高于非携带者;s CD22水平与脑脊液中Aβ42和Aβ42/Aβ40水平呈负相关,与磷酸化tau（Phosphorylate tau,p-tau）呈正相关;并且与脑内Aβ沉积水平呈正相关;与认知功能评分呈负相关,此外,在随访期间,血浆s CD22水平越高,认知能力下降越快。结论:1.年青正常骨髓移植可逆转老龄AD小鼠免疫衰老,并提高单核细胞Aβ清除能力。2.年青正常骨髓移植可减轻老龄AD小鼠脑内Aβ沉积、病理损害和认知障碍。3.野生型骨髓移植的老龄AD小鼠干预作用优于AD骨髓移植。4.血浆s CD22水平与AD脑内Aβ水平和认知损害相关,是AD潜在生物标志物。