目的:白血病细胞同其他肿瘤细胞一样,具有逃逸细胞周期调控、无限增殖的特点,诱导其凋亡是目前治疗白血病的主要方法之一。现代医学发现和厚朴酚除具有抗氧化、抗炎、抗焦虑、抗菌、抗血栓形成作用外,还具有抗肿瘤的作用。本课题旨在研究和厚朴酚对慢性粒细胞白血病急变期细胞株K562增殖、凋亡的影响。　　 方法:　　 1.体外培养K562白血病细胞株:采用含10％热灭活(56℃,30min)的小牛血清和青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)的RPMI1640培养基,在37℃、含5％CO2、饱和湿度下培养,3—4天换液传代一次。取对数生长期的细胞用于实验。　　 2.提取、培养健康人外周血单个核细胞:分别取3位健康成人供血者的血液各50ml,按血液:淋巴细胞分离液3:1的比例把血标本缓慢加入已装有淋巴细胞分离液的离心管中,整个操作过程始终保持在冰浴中进行。以2000g/min离心10min,收取单个核细胞层,洗涤3次后,以RPMI1640培养液重悬细胞后常规培养。　　 3.MTT法检测药物对K562细胞和健康人外周血单个核细胞的增殖抑制作用:取对数生长期K562细胞或健康人外周血单个核细胞,以5×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中培养。实验组设立8个药物浓度组,每组HNK的终浓度为5、10、15、20、25、30、35、40μg/ml,每个药物浓度组设8个复孔。对照组加入同样浓度的二甲基亚砜(DMSO),分别培养24小时和48小时,培养结束前4h每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml),2500 rpm离心20min,弃上清,加入200μl DMSO,振荡仪振荡10min,充分溶解结晶物,酶标仪测490nm处吸光度A值,计算增值抑制率。试验重复3次。　　 4.透射电镜观察K562细胞的超微结构变化:调整K562细胞密度为1×106细胞/ml,与终浓度为10μg/ml的HNK共培养10h,并设对照组。之后分别收集细胞,1000 rpm离心10 min,PBS洗一遍,4％戊二醛固定过夜,PBS沈3遍,1％锇酸固定1 h,PBS充分清洗。梯度乙醇脱水,丙酮浸透、包埋、超薄切片,醋酸双氧铀-柠檬双染,HITACHI1200ES型透射电镜观察细胞形态变化并拍照。　　 5.用AnnexinV/Pl双染细胞后用FCM法检测K562细胞和健康人外周血单个核细胞凋亡率变化:K562细胞和PBMCs分别在含有终浓度为0、10、15、20μg/ml HNK的RPMI1640培养基中培养24和48小时。在各实验终点,收集各组细胞,悬于binding buffer中,加入AnnexinV,避光室温反应15min,上机检测前加入PI。　　 6.Capase-3活性检测:按每孔1×106个细胞密度将K562细胞接种于6孔板,终浓度为10μg/ml的HNK处理6、12和24小时后,每个样本收集约2×106个细胞,加入50μl预冷的cell lysis buffer重悬细胞,冰浴10min,离心10000g/min,转移上清至新的Eppendorf管,置于冰上。测蛋白浓度后,加入相应cell lysis buffer稀释蛋白至相同浓度,加30入50μl反应液及5μl4mM DEVD-pNA,37℃孵育1小时后加入96孔板测OD405值,与对照组比较,计算增加倍数。　　 7.检测线粒体PT孔抑制剂CsA对细胞增殖的影响:分别取200μl密度为1×106个细胞/ml的K562细胞接种于96孔板,每孔加入终浓度为5μM的环孢菌素A(CsA),2小时后再加入终浓度为10μg/ml的和厚朴酚处理K562细胞6h和12h；同时设立HNK单独用药组,终浓度为10μg/ml,作用同密度的K562细胞200l6h和12h,每组设复孔3个。收集细胞,MTT法测定细胞增殖抑制率。　　 8.荧光实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase ChainReaction,RQ—PCR)检测凋亡相关基因bcl-2和bax mRNA的表达:Trizol提取细胞总RNA、合成cDNA后使用特异性引物扩增靶基因,Bcl-2的扩增条件:94℃变性45s,54℃退火45s,72℃延伸60s,35个循环。最后72℃延伸10min。Bax的扩增条件:94℃变性45s,58℃退火45s,72℃延伸60s,35个循环。最后72℃延伸10min。β-actin的扩增条件:94℃变性45s,58℃退火45s,72℃延伸60s,35个循环。最后72℃延伸10min。PCR产物的进行相对定量分析。　　 结果:　　 1.HNK抑制K562细胞增殖　　 结果显示HNK对K562细胞24小时的IC50为17.3μg/ml,48小时的IC50为8.9μg/ml；HNK高浓度组(25μg/ml)对K562细胞的生长抑制率均达90％,且抑制率随HNK浓度的加大和作用时间的延长而增大,呈现出剂量和时间依赖性。而对正常外周血单个核细胞的增殖抑制作用不明显。　　 2.电镜观察显示HNK可诱导K562细胞凋亡　　 经10μg/ml的和厚朴酚作用10h后,电镜观察K562细胞呈现凋亡形态学变化(包括细胞膜皱缩和起泡、染色质凝聚、核碎裂和凋亡小体的形成)。空白对照的K562细胞的电镜下形态,未见明显凋亡形态学变化。　　 3.AnnexinV/PI方法证实HNK可以诱导K562细胞凋亡　　 分别用10、15、20μg/ml的HNK作用于K562和PBMCs,培养24和48小时后,与处理前相比,处理24小时后K562细胞组凋亡细胞所占比例随着药物浓度的增加而增加(分别为10.5％±1.97、13.2％±3.12、28.7％±2.49),PBMCs组变化不明显(分别为8.4％±1.71、9.4％±1.86、11.5％±1.92),同时也发现,随着药物作用时间的延长,K562细胞组的凋亡率增加(24h:10.5％±1.97、48h:29.2％±2.18),而PBMCs组变化不明显(分别为8.4％±1.71、17.6％±1.46)。　　 4.HNK处理K562细胞后Caspase-3活性增强　　 10μg/ml的HNK处理K562细胞6、12、24小时后,各时间组K562细胞中caspase-3活性与空白对照组的比值分别为:1.49±0.02,3.27±0.31,10.11±0.13。12和24小时时间点HNK处理组K562细胞的Caspase-3活性与对照组相比有显著增高(P<0.01)。　　 5.线粒体PT孔抑制剂CsA能降低HNK对K562细胞的增殖抑制作用　　 单独用HNK或用线粒体PT孔抑制剂环胞菌素A(终浓度为5μM)与终浓度为10μg/ml的HNK联合处理K562细胞后,细胞增殖抑制率有所不同。HNK单独作用6h、12h的细胞增殖抑制率分别为7.45±0.25％,30.25±1.20％。而CsA和HNK联合作用6h、12h后,细胞增殖抑制率依次为2.14±0.41％和18.39±0.82％,较HNK单独处理组明显降低(P<0.05),同时5μM CsA对K562细胞基本无细胞毒作用。　　 6.HNK影响K562细胞bcl-2和bax mRNA的表达　　 与对照组相比,分别经5、10和15μg/ml的HNK处理24小时后K562细胞内Bax mRNA的表达量呈明显的剂量依赖性上升趋势(0.6832±0.0025,0.8504±0.0032,1.2161±0.0040,1.4023±0.0022)(P<0.01)。而Bcl-2 mRNA表达变化无统计学差异(p>0.05)。各浓度组的Bcl-2与Bax表达量的比值呈下降趋势(2.235,1.799,1.258,1.070)(p<0.01)。　　 结论:　　 1.和厚朴酚在体外对K562细胞增殖有明显抑制作用,呈时间、浓度依赖性。　　 2.线粒体途径可能是和厚朴酚诱导K562细胞凋亡的途径之一。　　 3.和厚朴酚在体外诱导K562细胞凋亡,可能是通过上调Bax蛋白表达实现的。