矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin3-O-glucoside，C3G)是自然界中分布最广的植物色素，属花色苷类，广泛存在于各种植物膳食成分中。C3G作为植物化学物质，其生物活性备受关注，研究表明C3G在各种慢性疾病如动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等慢病的防治中发挥重要作用。动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等慢病的发生和发展与某些细胞核内受体(NRs)的表达和功能的改变密切相关。近年来NRs与炎症的关系备受关注。LXRα和PPARγ可抑制某些受NF-κB激活的基因的转录，如病原体感染、IL-1β、TNFα、LPS引起的iNOS、IL-1β、IL-6、COX-2、MMP-9、MCP-1、MCP-3的增加。报道认为PPARs和LXRs能通过与p65形成胞质穿梭复合物、调节p38MAPK活性、与NCoR共抑制复合体结合于NF-κB的靶基因等途径抑制NF-κB激活的靶基因的表达。同时TNFα或LPS也可抑制LXRα和PPARγ的表达和活性，从而降低受二者调控的功能基因如载脂蛋白E、ABCA1、ABCG1和SREBP-1c等的表达。　　 我们实验室的前期研究和相关文献报道C3G增加了PPARγ和LXRα的表达以及转录活性。但是C3G调节核受体的作用机制尚不清楚，尤其是C3G是否作为配体直接调节核受体转录活性尚未见报道。我们在前期工作的基础上研究了C3G调节核受体PPARγ和LXRα转录活性的作用机制，并检测了C3G对受二者抑制的炎症因子TNFα和IL-6表达的影响。　　 方法：　　 ⑴C3G对PPARγ、LXRα等核受体的调节作用及机制分析。将人肝脏细胞系LO2接种于细胞培养板，用FuGENE(R)6分别将核受体(RXR、PXR、ER、FXR、LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ)质粒、对应的核受体反应元件-萤光素酶和绿色萤光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)转染到细胞中。培养过夜，更换新鲜培养基继续培养，第二天加入相应浓度的C3G孵育24小时，检测Luciferase强度和GFP强度；将非洲绿猴肾细胞株COS-7接种于10cm细胞培养板，按生产商提供的操作步骤，用FuGENE6转染试剂将含PPRE的质粒(PPRE×3-tk-Luciferase plasmid，PPRE×3-tk-LUC)和内参质粒pRL-TK-Renilla转染至细胞，或者将PPRE×3-TK-LUC、pCGN4-hPPARγ-HA质粒和pRL-TK-Renilla转染至细胞。重新接种并贴壁培养24小时。将不同浓度的C3G溶解到不含胎牛血清的DMEM中，孵育已转染质粒的COS-7细胞，以罗格列酮孵育组为阳性对照。PBS清洗细胞，细胞裂解液裂解，采用罗氏公司的Dual Luciferase Reporter Assay System和萤光检测仪检测，以Renilla的强度作为校正；将人THP-1细胞接种于六孔细胞培养板，以PMA诱导分化48小时。PBS洗3次，换成含10％(v/v)胎牛血清的新鲜RPMI1640培养基培养24小时。饥饿12小时后用不同浓度的C3G干预培养16小时，实时定量PCR检测LXRα和其下游基因ABCG1 mRNA的表达。　　 ⑵C3G对LPS诱导核受体的活性及炎症因子TNFα和IL-6表达的影响。将COS-7接种于培养板，用FuGENE6转染试剂将PPRE×3-TK-LUC、pCGN4-hPPARγ-HA质粒和pRL-TK-Renilla转染至细胞。重新接种并贴壁培养24小时。50μM C3G预孵育已转染质粒的COS-7细胞(对照为DMSO处理)15min，而后换成含罗格列酮和LPS的DMEM培养细胞16小时。PBS清洗细胞，以细胞裂解液裂解，采用罗氏公司的Dual Luciferase Reporter Assay System和萤光检测仪检测萤光强度，以Renilla的强度作为校正。Western blotting实验检测了C3G对PPARγ磷酸化的影响；分化贴壁的THP-1细胞中加入PPARγ抑制剂GW9662或LXRα抑制剂GGPP与LPS，或C3G和LPS干预培养16小时，采用实时定量PCR检测TNFαmRNA含量，观察GW9662和GGPP对C3G作用效果的影响；分化贴壁的THP-1先以IκBα磷酸化抑制剂BAY11-7082预处理细胞0.5小时，再进行C3G和LPS共同干预培养。实时定量PCR检测BAY11-7082预处理对LPS引起的炎症因子TNFα和IL-6表达改变的影响以及对C3G作用效果的影响；Western blotting检测BAY11-7082预处理对LPS引起的SRC-1蛋白改变的影响以及对C3G作用效果的影响。　　 结果：　　 ①C3G对核受体的调节作用及机制分析。高通量核受体筛选实验表明C3G在高浓度条件下(100μM)对核受体PXR、LXRα、LXRβ、PPARγ表现出一定的激活作用，与对照0.1％DMSO组相比，分别为对照的1.87、1.51、1.65、1.74倍；利用人THP-1单核/巨噬细胞研究C3G对PPARγ mRNA和蛋白质表达的影响。实时定量PCR结果显示1-100μM C3G处理细胞16小时未增加PPARγ mRNA的表达，但50μM C3G显著增加了PPARγ的蛋白质含量(P＜0.05)。在加入蛋白酶体抑制剂PS341后，与DMSO组相比，C3G不再显著增加PPARγ的蛋白质含量(P＞0.05)；在TR-FRET试验中，人工合成的LXRα配体GW3965在1.69nM-11111.11nM范围内随浓度增加而增强了荧光能量转移的能力(TR-FRET比率)，并且TR-FRET比率—浓度的对数作图呈现了典型的配体结合的S型曲线，而C3G并未显著增加荧光能量转移，在1.69nM-300000nM范围内亦未呈现TR-FRET比率—浓度对数的S型曲线，说明C3G不是LXRα的直接配体。　　 ②C3G对LPS影响的核受体活性及炎症因子TNFα和IL-6表达的作用。在转染了PPARγ和PPRE×3-TK-LUC的COS-7细胞中，LPS处理16小时降低了PPARγ的转录活性；与LPS组相比，50μM C3G预处理细胞15min即显著抑制了LPS对PPARγ转录活性的降低(P＜0.05)。Western blotting实验表明C3G抑制了PPARγ的磷酸化；1ng/mL LPS干预培养16小时显著增加了THP-1细胞TNFα和IL-6 mRNA的表达和蛋白质的分泌。1ng/mL LPS与0.5μM C3G共同干预培养则显著抑制了LPS对二者mRNA和蛋白质表达的诱导；在PPARγ抑制剂GW9662和LXRα抑制剂GGPP处理的THP-1中，C3G对LPS诱导的TNFαmRNA表达的影响不再显著；1ng/mL LPS干预培养16小时对THP-1细胞SRC-1 mRNA表达无影响，却显著降低了蛋白质水平，0.5μM C3G干预培养16小时对SRC-1 mRNA表达也无影响，但恢复了LPS降低的SRC-1蛋白质水平；C3G显著抑制了LPS刺激的IκBα磷酸化及NF-κB的入核转运。抑制剂BAY11-7082预处理细胞0.5小时，抑制了LPS引起的炎症因子TNFα和IL-6表达的升高和SRC-1蛋白的降低，并且C3G的干预效果亦不再显著。　　 结论：　　 ⑴高通量筛选实验表明C3G在高浓度条件下对部分核受体表现出弱的激活作用。这些核受体包括PXR、LXRs、PPARγ等。细胞实验和体外TR-FRET实验表明C3G具有增强PPARγ、LXRα转录活性的功能(如增加了ABCG1的表达)，并抑制了PPARγ蛋白质降解，但C3G不是PPARγ、LXRα的直接配体。　　 ⑵C3G显著抑制了LPS造成的核受体转录活性的降低，分析其机制，可能与抑制核受体磷酸化和增加核受体转录共激活因子SRC-1的蛋白水平有关。　　 ⑶C3G显著抑制了LPS刺激的THP-1巨噬细胞中TNFα和IL-6的表达，表现出显著的抗炎症活性；C3G抑制LPS引起的IκBα磷酸化及NF-κB细胞核转运也是其发挥抗炎症作用的部分原因。