鱼类弹状病毒可引发多种鱼类发生流行性病害,如大口黑鲈、鳜鱼、乌鳢、笋壳鱼、黄鳝等。大口黑鲈又名加州鲈,属鲈形目,太阳鱼科,近年来加州鲈弹状病毒病给加州鲈养殖业带来了很大影响。面对该疾病,疫苗仍然是最主要的预防和保护方式。由于加州鲈弹状病毒病主要危害鱼苗,传统的注射免疫不能满足其需求,活疫苗因可以进行浸泡免疫成为该病防治的关键,而反向遗传学的发展为活疫苗研究提供了新的技术方向。本研究以加州鲈弹状病毒三水株（Micropterus salmoides rhabdovirus Sanshui 7,MSRV-SS-7）为研究对象,在前期证实其具有良好的免疫原性及安全性的基础上,建立其反向遗传操作系统,获得拯救病毒rMSRV-SS-7,对该拯救病毒进行生物学特性以及免疫原性分析,确定其与亲本毒具有相似的特性,为进一步研发新型载体疫苗提供技术平台。取得的主要结果如下:1、MSRV-SS-7株反向遗传操作系统的建立根据MSRV-SS-7基因组序列,将其分为两段（F1和F2）进行扩增,并在基因组5′端和3′端分别引入了锤头状核酶（Hammerhead ribozyme,Ham Rz）和丁型肝炎核酶（Hepatitis ribozyme,Hdv Rz）结构。利用两段之间重叠的酶切位点,连接组装到真核表达载体PCI的CMV-IE启动子下游,获得MSRV-SS-7基因组全长c DNA重组质粒PCI-MSRV-SS-7,同时构建了N、P、G、L四个结构蛋白的辅助质粒PCI-N、PCI-P、PCI-G、PCI-L。通过磷酸钙转染法,将五种必需原件共转染到鲤鱼上皮瘤细胞（Epitheliama papulosum cyprini,EPC）细胞上,2-3天后转接到鳜鱼脑组织细胞（Chinese perch brain cells,CPB）上,7天后取细胞上清混合液继续在CPB上传代,获得拯救病毒rMSRV-SS-7。经RT-PCR验证,其序列与亲本毒MSRV-SS-7株一致;间接免疫荧光实验（indirect immunofluorescence assay,IFA）显示,该拯救病毒在荧光显微镜下呈绿色荧光;蛋白免疫印迹（Western bloting）结果显示,该拯救病毒可以正常表达G蛋白。拯救病毒在CPB细胞上可以引起明显的细胞病变（Cytopathic effect,CPE）,能够稳定复制,在CPB细胞上的生长曲线与亲本毒保持基本一致,因此该拯救病毒保持了亲本毒在CPB细胞上的生物学特性,是其忠实拷贝。结果表明,本研究已经成功拯救出MSRV-SS-7株的基因克隆株。2、拯救病毒rMSRV-SS-7株的免疫原性分析用拯救病毒和亲本毒以浸泡免疫的方式对加州鲈进行免疫,免疫后用强毒鳜弹状病毒清远株（Siniperca chuatsi rhabdovirus Qingyuan,SCRV-QY）进行攻毒验证,经荧光定量PCR（fluorogenic quantitative PCR,q PCR）检测并统计死亡率,结果表明拯救病毒和亲本毒对加州鲈的免疫保护效果均为100%。取攻毒后第4天的加州鲈的脑组织进行检测,免疫组病毒载量明显小于对照组。通过q PCR检测免疫基因的表达水平,结果表明拯救病毒在加州鲈体内可以诱导先天免疫基因IRF-7、Mx、Viperin和获得性免疫基因Ig M的表达。q PCR检测表明,拯救病毒在加州鲈鱼体内可以进行复制增殖,在主要靶器官脑组织中具有一定的消长规律,感染前期（1-3天）增加缓慢,中期（4天）达到最高值,后期（5-6天）缓慢减少,7天时不能检测到。综上所述,本研究以MSRV-SS-7为亲本毒株,建立其反向遗传操作系统,经RT-PCR、IFA、WB鉴定,证实成功获得拯救病毒rMSRV-SS-7,并对拯救病毒进行了免疫原性分析,为开发新型载体疫苗奠定了基础。