【摘 要】
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Ⅱ型CRISPR/Cas9系统通过sgRNA识别目标基因组序列,介导Cas9对DNA进行切割,从而引入DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs).非同源末端结合(non-homologous end joining,
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Ⅱ型CRISPR/Cas9系统通过sgRNA识别目标基因组序列,介导Cas9对DNA进行切割,从而引入DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs).非同源末端结合(non-homologous end joining, NHEJ)方式修复DSBs易发生基因突变从而实现特定基因的敲除。肿瘤细胞需要有维持端粒长度的机制来实现无限分裂。研究表明约85%的肿瘤依赖端粒酶的激活,15%的肿瘤则依赖端粒的替代延长机制(alternative lengthening telomeres, ALT)通过同源重组的方式维持端粒长度。胰腺内分泌细胞瘤、脑胶质细胞瘤等多种肿瘤细胞中发现ATRX基因失活与端粒的替代延长机制紧密相关。为进一步揭示ATRX在ALT激活中的作用和ATRX对肿瘤发生的作用,本课题利用CRISPR/Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系。通过Western-blot在蛋白水平鉴定ATRX的表达和Sanger测序在DNA水平鉴定ATRX基因序列突变,成功建立了ATRX基因敲除的HeLa细胞系。
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