正常的人类体细胞内由于缺乏端粒酶的活性和端粒维持机制,细胞在增殖到一定的阶段后,端粒逐渐缩短,而使细胞发生复制型衰老(replicative senescence)。细胞衰老过程既协同又拮抗肿瘤的发生。一方面,细胞衰老过程中常常伴随DNA突变的累积、染色体的不稳定性、端粒功能结构异常等现象,从而有利于肿瘤的发生。另一方面,与细胞凋亡相似,衰老又作为拮抗肿瘤发生的重要机制存在于生物体中。细胞在增殖过程中接受各种外界压力以及自身复制压力,染色体容易产生突变和损伤,从而使细胞具有癌症潜能。机体为了避免细胞损伤所导致的细胞肿瘤化,往往通过诱导细胞进入衰老或凋亡的方式,以清除损伤细胞,抵御癌症的形成。因此,肿瘤的发生是肿瘤细胞丧失了调控细胞衰老、凋亡等DNA损伤监控机制的结果。同时,肿瘤细胞需要重新激活其端粒延长机制,以避免细胞快速增殖导致的端粒缩短。研究发现,85-90%的肿瘤发生都是通过重新激活端粒酶的方式,以逃脱衰老的抑制,继而形成增殖不受机体调控的肿瘤细胞。但仍然有10-15%的肿瘤不能重新激活端粒酶,这类肿瘤选择通过端粒延长替代(alternative lengthening of telomere, ALT)机制来维持细胞的端粒长度与功能。由于ALT肿瘤是端粒酶阴性的肿瘤,故而ALT肿瘤的研究对于了解衰老与肿瘤的发生的辩证关系极为重要。同时,在大量采用的针对端粒酶的肿瘤治疗策略中,肿瘤细胞会被迫选择激活ALT以求保持其生长。因此,研究ALT肿瘤的发生机制,对于协同针对端粒酶的肿瘤诊断和治疗也极为重要。本文旨在探明在ALT肿瘤中发现的一个突变p53蛋白(p53N236S或p53S)的功能丢失(loss of function)和功能获得(gain of function)。p53作为抑癌基因在细胞接收到外界压力信号时,会通过调控细胞周期阻抑和诱导细胞凋亡阻止细胞肿瘤化,在抑制肿瘤的形成过程中起着非常重要的作用。据统计,80%以上的ALT肿瘤细胞都存在p53或p53相关通路的缺失。同时,在32例各种类型的人类肿瘤中也发现了p53S突变。我们的前期实验中,从早老综合症(WS)小鼠模型的胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast, MEF)的G5mTerc-/-Wrn-/-细胞株中筛选到了七株永生化细胞,在比较研究了三株产生ALT肿瘤(ALT tumorigenic)的永生化细胞(3B-1,3B-2,9B-1)与四株不产生ALT肿瘤(Non-ALT tumorigenic)的永生化细胞(7A-1,7A-2,7A-3,6B-1)后,发现在三株能形成ALT肿瘤的小鼠胚胎成纤维细胞系中,存在同一个p53突变基因p53N236S(在人类中是p53N236S)的高表达。对p53N236S的蛋白三维结构预测表明,p53蛋白的这一突变,导致其DNA结构区域的氢键改变,提示p53N236S的蛋白不能有效的与下游靶基因结合。对3B-1,3B-2和9B-1这三株细胞的Western blot分析结果表明,伴随着p53和磷酸化p53的高表达,处于p53下游的p21CipI/Waf1的表达与野生型细胞相比则异常下调。提示在这三株形成ALT肿瘤的细胞系内,同时存在突变的p53和p53相关途径的功能紊乱。进一步我们采用Real-time PCR的方法检测p53下游基因的表达情况,结果发现在对1OGy的电离辐射损伤应激时,p53N236S不能像野生型p53一样调控Bax.PUMA等细胞凋亡通路蛋白的表达,以及p21、Cyclin G等细胞周期阻抑通路蛋白的表达。这提示p53N236S突变丧失了诱导细胞周期抑制与细胞凋亡的功能,从而导致肿瘤的发生。接下来,我们将p53S转入p53敲出的细胞(p53--)细胞内,以研究p53S这一突变的功能获得。然而,SCID小鼠皮下注射结果显示,在p53-/-中单独表达p53N236S并不形成肿瘤(p53-/-+S),说明p53S本身并不足以形成肿瘤。而当p53-/-细胞中共表达p53N236S和癌基因H-RasG12V时,p53N236S会协同H-RasG12V促进肿瘤的形成。且与H-RasG12V诱导的p53-/-细胞相比,其形成肿瘤的时间更短、成瘤体积更大,提示p53N236S蛋白获得了新的功能,可协同H-RasG12v作用促进肿瘤的发生。通过Westernblot的分析,我们发现,当共表达p53N236S和H-RasG12V时,可以部分削弱由p53N236S或H-RasG12V所引起的应答反应,这可能有利于细胞生长和肿瘤形成。此外,流式细胞术分析细胞周期的结果表明,与p53-/-+vector+Ras相比,p53-/-+S+Ras细胞处于G1/G0期的细胞减少,处于S期的细胞增多。这一结果进一步证明了p53S与H-RasG12V协同促进细胞的增殖。染色体核型分析结果显示,p53-/-+S+Ras细胞相比于p53-/-+vector+Ras细胞,p53-/-+S相比于p53-/-细胞和野生型细胞,都有双微体结构和非整倍体(2N>40)增多的现象。这提示p53S的加入会促进染色体不稳定现象的发生,并且与H-RasG12V之间有协同加剧染色体不稳定的潜能。以上结果表明,ALT肿瘤中发现的p53N236S以功能获得的形式具有癌基因潜能并与H-RasG12V协同促进肿瘤形成。我们在国家基金项目的资助下(课题编号30771194),成功建立了具有自主知识产权的p53N236S基因敲入小鼠模型。在此模型的基础上,我们建立了内源性纯合(p53s/s)以及杂合(p53s/+)表达p53S的MEF细胞系。在p53s/+和p53+/+细胞中瞬时转染H-RasG12V时,p53S/+和p53+/+细胞中都出现了大量增殖缓慢,形态扁平而膨大的衰老细胞,且SA-β-Gal染色结果显示,在p53S/+瞬时表达H-RasG12V细胞中约有68.75%的细胞发生衰老。但当H-RasG12V在p53S/+细胞中持续表达至10代以上后,发生衰老的细胞迅速减少。且p53S/++H-RasG12V后期的细胞在SCID小鼠皮下注射时会产生肿瘤。这提示在持续的癌基因表达的压力下,野生型p53等位基因的功能被抑制。在对p53S+.H—RasG12V晚期细胞基因组的p53基因进行PCR扩增时,发现其野生型等位基因所扩增出的条带明显减弱。提示p53等位基因发生了杂合丢失现象(Loss of heterozygote, LOH),使得野生型等位基因丢失。为探明在H-RasG12V表达的背景下,p53S/+发生杂合丢失的分子机制,在p53S/+,p53+/+和p53S/S三株细胞系转染H-RasG12V的不同时间段,对p53相关的分子通路蛋白进行Western blot分析。在p53S/+细胞中转染H-RasG12V24h后就会起p21的表达,这与在野生型(p53S/+)细胞中转染H-RasG12V一样。有趣的是,当H-RasG12V在p53S/+细胞中持续表达一个月左右时,p21的表达水平与瞬时转染24h时相比有所下降。并且此时细胞中的p53和磷酸化p53的表达水平急速升高,同时Hsp70和p19ARF也迅速升高。这一结果提不H-RasG12V癌基因的信号在p53S/+的细胞背景中,瞬时表达并不会引起细胞的肿瘤化,但当这一增殖信号持续存在一段时间后,细胞则会逃逸衰老,启动其肿瘤化进程。最后,我们发现,H-RasG12V使得p53S/+细胞对DNA合成抑制剂阿霉素的处理不敏感。以上数据表明,在H-G12V的高表达使得p53S内源表达的杂合子细胞系中发生了杂合子丢失,p53野生型等位基因的功能丧失,从而使细胞发生肿瘤化。综上所述,我们在三株相对独立的WS MEF细胞产生的ALT肿瘤中发现了p53N236S,并对这一突变的特性进行研究。发现p53N236S丧失了诱导细胞周期抑制与细胞凋亡的功能。同时,p53N236S这一突变又使其获得了癌基因的潜能,并能与Ras协同促进肿瘤的形成。最后通过研究内源性表达p53N236S的细胞系,发现在H-RasG12V高表达的背景下, p53S/+杂合子细胞中的p53野生型等位基因由于发生杂合子丢失而丧失功能,使细胞逃离衰老形成肿瘤。对p53N236S这一突变的结构及其功能获得的研究为了解其在肿瘤,尤其是ALT肿瘤,发生和发展中的作用和针对其进行的靶向治疗提供了重要的科学依据。