类柠檬苦素是柑橘中特异存在的三萜类物质,是一类具有抗癌、降低胆固醇、抗病毒和消炎等生物活性的次生代谢产物,对人体健康具有较大的价值。本研究以12个柚类品种为实验材料,分析不同发育过程中不同组织的柠檬苦素和诺米林的积累与分布规律,研究类柠檬苦素生物合成的时空动态规律及遗传差异,寻找特异表现型的遗传种质资源。以茎段韧皮部、种子和三个发育时期的叶片为材料,通过转录组测序、生物信息学和分子生物学等方法筛选和验证调控类柠檬苦素生物合成的候选基因。克隆与类柠檬苦素合成高度相关的角鲨烯合成酶基因(Ci SQS)和氧化角鲨烯合成酶基因(Ci OSC),并构建和利用转基因技术对Ci SQS和Ci OSC基因的功能进行分析,探讨Ci SQS和Ci OSC基因对柑橘类柠檬苦素生物合成的作用。主要结果如下:1.柚类果实中柠檬苦素和诺米林的时空分布。HPLC检测结果显示,果实完全成熟时,种子中的类柠檬苦素含量(柠檬苦素和诺米林的总含量)在1233.78~4090.41 mg/kg FW之间。ANOVA分析显示,12个柚子品种中的柠檬苦素和诺米林的总含量差异显著。以种子中的类柠檬苦素含量为参数进行聚类,12个品种可以分为三类。类柠檬苦素含量最高的早熟暹罗蜜柚、勐仑早柚、宜安倭柚聚在一类,与来源于中国南方的9个柚品种有较大差异。表明类柠檬苦素的含量主要受遗传背景影响。当种子开始生理成熟时,诺米林和柠檬苦素的含量明显增加,说明种子的生理成熟是类柠檬苦素开始快速积累的关键节点。当果实转色至10%时,诺米林和柠檬苦素含量达到最大值。果实成熟后,从11月至次年1月,随着气温的下降,种子和囊衣中的柠檬苦素和诺米林含量基本呈现上升的趋势。2.类柠檬苦素生物合成相关基因的鉴定。利用东风早柚的种子(SII)、韧皮部(PII)和三个发育时期的叶片(LI、LII、LIII)进行转录组测序,共得到14,551,995(LI)、13,302,783(LII)、14,900,160(LIII)、18,151,136(PII)和14,978,415(SII)个clean reads。根据类柠檬苦素的含量,以LI为参照,对转录组数据进行两两比对,差异基因数为2,086(LII VS LI)、4,082(LIII VS LI)、5,837(PII VS LI)和9,428(SII VS LI),这四组基因中共有的差异基因数为924个。Map Man软件分析发现,924个差异基因包含30类不同功能的基因。主要的功能分别为RNA调控、蛋白质修饰和降解、信号、细胞、次生代谢、激素代谢和细胞壁等。其中,有14个参与萜类物质的生物合成。利用MEV软件分析LII VS LI、LIII VS LI、LIII VS LII三组叶片差异基因的表达模式,K-means聚类结果显示,三种表达模式的基因(共382个基因)可能与类柠檬苦素的含量相关,其中只有Ci OSC基因参与萜类的生物合成。不同物种的OSCs聚类结果表明,Ci OSC分别与南瓜(Cucurbita pepo)和黄瓜(Cucumis sativus L.)中葫芦素生物合成途径的第一个关键基因CPQ和Bi聚在一起。qRT-PCR结果显示,Ci OSC基因在类柠檬苦素高含量的广西沙田柚、北碚447锦橙等柑橘的叶片中具有较高的表达水平,在低含量的滑皮金柑、融安金柑、旺苍皱皮柑、宫川温州蜜柑和丹娜香橼等柑橘中的表达量较低。Ci OSC基因的表达量与类柠檬苦素含量在早熟暹罗蜜柚和广西沙田柚的种子发育进程中具有极为相似的变化趋势,表明Ci OSC与类柠檬苦素的生物合成有高度相关性。因Ci OSC与合成类柠檬苦素所需的萜类物质的生物合成相关,据此推测,Ci OSC是处于类柠檬苦素生物合成途径上游的重要基因。另外,RNA-seq分析还鉴定出19个与类柠檬苦素生物合成相关的候选基因,主要包括5个转录因子、6个CYP450s、3个UGTs、1个乙酰转移酶基因、1个生长素响应蛋白、1个木葡聚糖内糖基转移酶和2个转运蛋白。这些基因的表达量随着种子的发育具有与类柠檬苦素含量变化类似的模式,CYP450基因家族的Ciclev10000886m、Ciclev10030087m、Ciclev10022473m和Ciclev10025448m基因与类柠檬苦素的含量达到显著相关水平,相关系数分别为0.995a、0.985b、0.958b和0.981b。MYB家族的Ciclev10021695m和生长素响应蛋白Ciclev10029650m基因也表现出显著相关性。随着种子的发育,三个UGTs基因(Ciclev10020010m、Ciclev10015042m和Ciclev10001658m)的表达量在高含量的早熟暹罗蜜柚种子中与类柠檬苦素含量呈负相关,而在低含量的广西沙田柚种子中,其表达量与类柠檬苦素含量呈正相关。ABC家族的转运蛋白(Ciclev10011147m和Ciclev10003388m)的表达量与生长发育时期的种子中的类柠檬苦素含量具有较高的相关性,且在种子中特异表达,表明其可能参与类柠檬苦素的转运。3.CiSQS基因的结构、表达及与类柠檬苦素含量的关系。通过RACE技术克隆得到1813bp的Ci SQS基因全长c DNA序列,ORF分析发现,CDS区长度为1242 bp,编码413个氨基酸,预测的分子量为47.37 k Da。SQS基因在18个柑橘品种中高度保守,其c DNA序列有99%的相似度。对CDS区的SNP位点进行分析发现41个多态性位点,平均SNP突变频率为1个/329 bp。有26个同义突变和非同义突变引起了氨基酸的改变,靠近3’端的核苷酸突变分别引起小果罗浮终止子提前出现和融安金柑的CDS区变长。小果罗浮、融安金柑和4号宜昌橙在CDS区第14位碱基都发生了G/C同义突变。这三个类柠檬苦素低含量的品种在进化树上聚在了同一类,与其它品种明显不同。结果表明,第14位核苷酸的区域可能与类柠檬苦素的含量有较为密切的关系。基因表达分析结果显示,不同柚子品种的种子中的Ci SQS基因表达水平与类柠檬苦素含量较一致,但在低含量的琯溪蜜柚和坪山柚中基因的表达量反而较高。随着琯溪蜜柚和坪山柚的种子发育,表现出与类柠檬苦素含量相似的变化模式,但在最低含量的坪山柚ST1时期种子中的基因表达量却为最高。表明Ci SQS基因的表达没有显示出和类柠檬苦素含量之间有显著相关性。利用qRT-PCR分析低温、Me JA、SA、GA3和Na Cl等非生物胁迫处理下的植株发现,低温能显著诱导CiSQS基因的表达。4.Ci SQS基因为类柠檬苦素生物合成的相关基因。构建了Ci SQS基因的植物过量表达载体p BI121GSH-SQSOE、干扰载体p GBi-SQSRNAi和p GBi-SQSRNAi-N。通过农杆菌浸染法转化锦橙上胚轴,得到3株SQSOE过表达植株和4株SQSRNAi-N干扰转基因植株。HPLC分析表明,3株SQSRNAi-N干扰植株叶片中的类柠檬苦素含量减少,为对照的72.24~95.12%。而Si N-3植株叶片中的柠檬苦素和诺米林总含量则上升,为对照的1.24倍。在所有Ci SQS干扰株系中,柠檬苦素含量减少最显著,为对照的35.83~81.56%。造成Si N-3植株中总含量增加的原因是由诺米林含量增加而引起,Si N-3和Si N-4株系叶片中的诺米林含量分别为对照的1.53倍和1.35倍。由于SQS是合成许多植物激素类物质前体的关键酶,因此基本得不到SQS完全沉默的转基因植株。在所获得的几株转基因植株中虽然发现Ci SQS的表达被部分沉默,并与类柠檬苦素的含量有一定相关性,但关系并不显著,说明Ci SQS对类柠檬苦素生物合成的影响较小,距类柠檬苦素生物合成途径有较远的距离。qRT-PCR结果表明,Nos弱启动子引起的Ci SQS基因沉默,4个植株的SQS表达水平都受到抑制,为对照的61%~79%。转基因株系中OSC类型的123βAS、195ATLUP2、330βAS、632βAS、951CAS1等基因的表达水平在大多数Si-N株系中都受到抑制,789ATLUP2、490CAMS1、602CAS1基因在大多数沉默植株中的表达量反而升高。结果表明,在Ci SQS干扰的株系中,不同类型的OSC基因可能存在竞争性抑制关系。3株过表达植株中仅有SOE-1正常生长,嫁接9个月后,SOE-2仅长出两片新叶,SOE-3仍保持嫁接时的状态。SOE-1叶片中的类柠檬苦素含量显著减少,为对照的68%。但SOE-1和SOE-2株系中的Ci SQS基因表达水平分别为对照1.45倍和1.31倍。在两株过表达植株中,不同类型的OSC基因表达水平出现既有上升也有下降的现象。进一步印证不同的OSC基因间可能存在竞争性抑制关系。与过表达株系出现植株发育不正常类似,Ca MV 35S启动子驱动的7个Ci SQS干扰株系出现叶片坏死、芽发育不正常,最后死亡。这些现象说明SQS与植物的一些重要代谢功能关系密切,对其进行调控易导致植物基本代谢的失调。5.柑橘TRV介导的VIGS系统的构建及基因沉默对Ci OSC基因的功能验证。从广西沙田柚中克隆到了沉默后能引起叶片出现光漂白现象的Ci CHll基因,将其作为标记基因构建到来自本生烟的TRV2病毒载体,首次构建了用于基因沉默的柑橘TRV介导的VIGS系统。在用含Ci CHll标记基因的菌液浸染柑橘植株第7天后(7 days post infiltration,7dpi),新叶出现光漂白现象;14 dpi时,大多数叶片都表现出Ci CHll完全沉默的特征;至27dpi,整株植株出现大面积的黄化,表明来源于柑橘的Ci CHll可以作为VIGS沉默的标记基因。用不同遗传背景的柑橘品种为材料,测试并优化了柑橘的VGIS沉默体系。墨西哥莱檬是最敏感的品种,黄化面积占叶面积的65.5%,广西沙田柚的敏感性较低,只表现出少量的光漂白现象。通过对浸染菌液的OD600值、浸染叶片的发育程度和使用的植物材料的发育时期等条件的试验优化。建立了能有效用于柑橘基因功能验证研究的VIGS系统。利用VIGS沉默广西沙田柚种子萌发的幼苗中的Ci OSC基因后发现,6株幼苗中的Ci OSC基因表达水平受到明显抑制,类柠檬苦素含量也显著减少,为对照的41.04~65.33%。2号株系中Ci OSC基因表达水平受到的抑制最显著,为对照的9.09%,柠檬苦素和诺米林含量分别为对照的35.08%和44.49%。表明Ci OSC基因能调控类柠檬苦素的生物合成,可能是类柠檬苦素生物合成途径上游的一个重要基因。