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乳酸链球菌素(Nisin),又称乳球菌肽,或乳链菌肽,是从乳酸链球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis)发酵物中提取的一种多肽类抗菌物质,广泛用作生物性食品防腐剂,对奶牛乳房炎主要病原菌(葡萄球菌和链球菌)有杀灭作用,而且不与医用抗生素产生交叉抗药性,对人体无毒副作用,能在肠道中降解,对环境无害。因此,Nisin潜在着开发成治疗奶牛乳房炎的新型无公害制剂的可能性。本文对国产Nisin的物理化学特性、在不同环境中的稳定性、体外抑菌作用以及效价检测方法进行了研究,为进一步研制开发Nisin新制剂提供基础。
Nisin理化特性研究表明,Nisin在pH值较低的溶液中有较强的抑菌活性,随着溶液pH值的上升抑菌活性逐渐降低,当溶液pH值为7时,Nisin抑菌活性只有pH2—3时的50%左右;在不同pH的溶液中,热处理对Nisin的抗菌活性产生不同程度的影响,pH值在2—3时,121℃高温处理后Nisin效价几乎不变;pH值高于3时,高温处理可使Nisin失活;在Nisin溶液中加入α—胰凝乳蛋白酶可使Nisin变得无抗菌活性。
将Nisin(7.5mg/ml)溶于维生素C(10mg/ml)、柠檬酸(0.01mol/L)和盐酸(0.02mol/L)三种溶液中,另将Nisin粉末和维生素C按同上的浓度比例均匀混合成粉剂进行稳定性试验。结果表明,Nisin在水液体溶液中不稳定,保存到第6个月时,Nisin在三种液体溶液中效价分别降低了28%、43%、25%,溶液pH值分别升高了32%、55%、65%;Nisin粉末与维生素C配合的粉剂经光照加速试验、高温高湿加速试验和长期保存试验后,Nisin的抗菌活性稳定;在4℃、25℃和室温保存一年后Nisin效价和溶解后的pH值均无显著变化,说明性质稳定。
对20株从杭州郊区奶牛场的乳房炎病例中分离到的金黄色葡萄球菌进行了体外药敏试验。结果表明,对苯唑青霉素、链霉素、庆大霉素、氟哌酸、复方新诺名耐药的金黄色葡萄球菌株分别为80%、95%、45%、75%、90%;该20株金黄色葡萄球菌菌株和另外分离到的20株无乳链球菌菌株对Nisin敏感。
在进行Nisin在牛奶中的抗菌活性研究过程中,为了解决不能通过观察浊度来了解细菌是否在牛奶中生长的问题,建立了用于检测抗菌类药物在牛奶最低抑菌浓度(MIC)的TTC法。Nisin在普通肉汤培养基和牛奶中对金黄色葡萄球菌的平均最低抑菌浓度(MIC)分别为35.3IU/ml、75.5 IU/ml,对无乳链球菌的平均最低抑菌浓度(MIC)分别为40.5 IU/ml、105.0 IU/ml。
Nisin的检测新方法研究。以藤黄微球菌为指示菌,检测不同浓度Nisin的抑制作用下,细菌还原MTT生成甲瓒的数量,建立Nisin浓度与OD值的线性关系,通过读取OD值间接得出样品Nisin的效价;试验对细菌浓度、比色时间、孵育时间进行了优化,得出指示菌浓度为105CFU/ml,Nisin作用时间为4h,MTT作用时间为2h时,Nisin浓度在0.125—32IU/ml范围内效价浓度与OD值成较好的线性关系(y=—0.0299x+0.7465,R2=0.975);运用MTT比色法检测了五组样品,并与国标琼脂扩散法进行了比较,MTT法所得到的结果与国标琼脂扩散法的结果是相吻合的(y=1.0064x+1.3314,R2=0.9995),MTT法具有更高的准确度和更短的时间。