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miRNA（microRNA）是一类长度在20-25bp的内源性单链RNA分子，不编码蛋白质，由一段具有发夹结构的单链RNA剪切而成，通过与靶基因mRNA的结合，调控多种生命过程。近年来的研究发现，病毒也可以编码miRNA，来调控宿主及其自身的基因表达以适应其在宿主体内的生活。BmCPV是典型的RNA病毒，我们团队前期研究发现它可以编码有功能的miRNA，并能够改变宿主细胞基因的表达水平。本文以家蚕和BmCPV为试验材料，通过RNA深度测序，筛选出BmCPV感染家蚕过程中特异性表达的miRNAs，选取其中一个BmCPV-miR-1进行深入研究，并通过软件预测其靶基因；用实时定量的方法检测miRNA和靶基因表达水平的变化；分别构建包含miRNA前体和靶基因的慢病毒表达载体，依次转染HEK293细胞，验证BmCPV-miR-1对其靶基因表达的调控作用；同时化学合成BmCPV-miR-1 mimics，在家蚕细胞水平和蚕体水平分别验证BmCPV-miR-1对其靶基因的调控作用；最后通过蚕体注射mimics验证BmCPV-miR-1对病毒自身复制的影响。得到的主要实验结果如下： 1.感染BmCPV后家蚕中肠内BmCPV-miR-1及其靶基因表达发生变化 通过软件分析小RNA深度测序数据，并经茎环RT-PCR鉴定，我们得到8条可能由BmCPV基因组编码的miRNAs；本文选取其中一条miRNA即BmCPV-miR-1进行深入研究，它位于病毒基因组的第一片段上，茎环qRT-PCR结果表明BmCPV-miR-1在感染BmCPV的家蚕中肠组织中随感染时间增加呈明显上调表达模式。同时，采用miRanda和Targetscan两种靶基因预测软件分别针对家蚕基因组和BmCPV基因组进行靶基因预测，获得一大批BmCPV-miR-1可能的靶基因，根据它们的功能，我们选取了其中一个涉及细胞凋亡的基因--家蚕细胞凋亡抑制因子（Bombyx moriinhibitor of apoptosis protein，BmIAP）基因，该基因能够抑制家蚕细胞的凋亡，而且定量结果显示家蚕感染BmCPV后BmIAP基因在中肠的表达量明显升高，趋势与BmCPV-miR-1相一致。 2.BmCPV-miR-1对BmIAP基因表达具有正调控作用 （1）构建能够表达靶基因的慢病毒表达载体pLNHX-UTR-mCherry-IAP，和辅助质粒一起共转染HEK293细胞，通过在荧光显微镜下观察mCherry的红色荧光来确定转染成功；然后构建表达BmCPV-miR-1的质粒pLKO.3G-miR-1，和包装质粒共转染上一步的细胞，通过检测质粒自带的绿色荧光确定转染成功，分别在转染后24h、48h收集细胞，使用荧光定量PCR检测BmCPV-miR-1对靶基因BmIAP的表达调控。结果显示，BmCPV-miR-1能够上调BmIAP基因的表达，且经过BmCPV-miR-1与BmIAP基因5′UTR靶位点序列比对分析，证明它们的确可以互补结合形成稳定结构，因此我们认定BmCPV-miR-1能够与靶基因的5′UTR序列结合，而正调控IAP基因的表达水平。 （2）为进一步验证BmCPV-miR-1对家蚕IAP基因的调控作用，采用化学法合成了BmCPV-miR-1 mimics及阴性对照NC序列，分别转染家蚕BmN细胞，并于24h、48h和72h后收集细胞，qRT-PCR检测BmIAP基因表达情况，结果显示，BmIAP基因在转染BmCPV-miR-1 mimics后24h开始呈上调表达，48h内表达水平上调幅度不大，但到72h表达水平急剧上升，且上调水平极显著，NC组与对照组相比，基因表达均无明显差异。该结果直接证明了BmCPV-miR-1对BmIAP基因的表达起正调控作用。 （3）采用体腔注射技术，分别将1μg与2μg的BmCPV-miR-1mimics注射家蚕体内，注射后不同时间点取家蚕脂肪体及中肠组织，提取总RNA反转录，通过实时荧光定量PCR检测BmIAP基因在不同时间段的表达情况。结果发现，注射低剂量的mimics，BmIAP基因在脂肪体和中肠组织中均有稍微的上调趋势，而注射高剂量的mimics，BmIAP基因在两个组织均有非常明显的上调趋势，且差异极显著；与之对照的注射DEPC水和NC组，BmIAP基因表达量无明显差异。进一步证明BmIAP基因是BmCPV-miR-1的靶基因之一，且BmCPV-miR-1能够正调控靶基因的表达。 3.BmCPV-miR-1能够促进BmCPV的增殖 对感染BmCPV的五龄家蚕幼虫体腔注射BmCPV-miR-1 mimics，inhibitors和NC，于不同的时间点收取家蚕中肠组织，提取总RNA反转录，qRT-PCR检测病毒基因组RNA第二片段（编码RNA-dependent RNA polymerase,RDRP）和第十片段(编码多角体蛋白)的复制表达情况。结果显示，48h内病毒的两个RNA片段都处于较低的复制水平，从72h开始三组都出现上升，上升最多的是注射mimics的一组，NC组次之，inhibitors上升的最少，96h时这种趋势更加明显。推测这是由于mimics上调了家蚕细胞BmIAP基因的表达，进而抑制了细胞的凋亡，给病毒提供了更好的繁殖环境，而inhibitors下调了BmIAP基因，促进了细胞凋亡，不利于病毒的繁殖。由此证明了BmCPV通过编码BmCPV-miR-1上调家蚕BmIAP基因而促进自身的增殖。 本实验对BmCPV-miR-1及其靶基因BmIAP基因的研究结果，将为BmCPV与家蚕免疫互作机制的研究提供新的线索，也能为其他病毒miRNA的研究提供新的思路。