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【背景】肺癌是我国发病率和死亡率均居高不下的恶性肿瘤之一,在世界范围内亦是如此。吉非替尼作为靶向EGFR突变的非小细胞肺癌的一线治疗药物能够有效提高患者的总生存期,但是吉非替尼的获得性耐药是严重限制非小细胞肺癌患者预后水平重要原因之一。外泌体和环状RNA在肿瘤的发生发展和治疗中均发挥重要作用,然而外泌体环状RNA是否参与吉非替尼获得性耐药机制的研究罕有报道。【目的】1.探究非小细胞肺癌吉非替尼敏感与耐药细胞外泌体中的高通量测序circ RNA差异表达谱。2.探究circ KIF20B在吉非替尼耐药患者血清外泌体和非小细胞肺癌组织中的表达水平,分析circ KIF20B表达与非小细胞肺癌患者临床基线资料的相关性。3.研究circ KIF20B对非小细胞肺癌细胞系中的生物学功能,包括吉非替尼耐药性、细胞增殖性、细胞周期、细胞凋亡等。4.研究circ KIF20B/mi R-615-3p/MEF2A信号轴的功能。5.探讨基于外泌体装载系统的circ KIF20B对于治疗吉非替尼耐药性的研究。【方法】1.通过超高速梯度离心和外泌体提取试剂盒提取相关细胞和血清样本中的外泌体,并使用电子显微镜、粒径分析仪和Western blot分析验证外泌体的存在。2.通过高通量测序挖掘非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞和吉非替尼敏感细胞外泌体中circ RNA差异表达谱,筛选出目标分子circ KIF20B并进行表征鉴定。3.通过梯度浓度培养法构建吉非替尼耐药的肺腺癌细胞系（PC9GR）和吉非替尼耐药的肺腺癌细胞系（HCC827GR）,使用CCK-8验证上述细胞的耐药性。4.通过q RT-PCR检测circ KIF20B在接受吉非替尼治疗的患者血清外泌体中和手术切除的非小细胞肺癌组织中的表达水平,结合临床基线资料分析circ KIF20B的临床相关性。5.以PC9、PC9GR、HCC827和HCC827GR细胞系为目的细胞,构建circ KIF20B敲减和过表达稳定转染细胞株,通过Western blot检测细胞周期和细胞凋亡相关蛋白;通过CCK-8检测、Edu细胞增殖实验、流式细胞周期分析、流式细胞凋亡分析等方法验证circ KIF20B对非小细胞肺癌吉非替尼耐药性、细胞增殖性、细胞周期进程、细胞凋亡水平等方面的生物学作用。6.通过异种移植肿瘤模型验证circ KIF20B在体内实验层面对非小细胞肺癌肿瘤发生发展的生物学功能。7.通过生物信息学分析、RNA下拉试验、RNA免疫共沉淀、萤光素酶报告基因和荧光原位杂交等方法验证circ KIF20B与mi R-615-3p的相互作用以及mi R-615-3p与MEF2A的相互作用;q RT-PCR检测mi R-615-3p和MEF2A在吉非替尼耐药患者血清外泌体和非小细胞肺癌组织中的表达水平;过表达和敲减实验验证mi R-615-3p和MEF2A对吉非替尼IC50值的作用。8.过表达和敲减circ KIF20B、mi R-615-3p和MEF2A,并且构建拯救实验分组。通过CCK-8检测、Edu细胞增殖实验、流式细胞周期分析、流式细胞凋亡分析和Western blot等方法探究circ KIF20B/mi R-615-3p/MEF2A轴在非小细胞肺癌细胞株中的生物学作用。9.通过A T P合成检测、线粒体膜电位检测、耗氧量测定等方法研究circ KIF20B/mi R-615-3p/MEF2A轴对非小细胞肺癌细胞的氧化代谢调控作用。10.通过外泌体共培养方法探究外泌体circ KIF20B对受体细胞的生物学调控作用。【结果】1.成功提取血清外泌体和细胞上清外泌体并鉴定。2.通过测序筛选出376个显著差异表达的外泌体来源的circ RNAs,circ KIF20B是显著低表达的分子之一。表征实验证明了circ KIF20B的环形结构以及circ KIF20B在细胞质中富集并且对核酸外切酶Rnase R和放线菌素D具有抗性。3.Circ KIF20B在吉非替尼耐药患者（n=24）的血清外泌体和非小细胞肺癌患者（n=85）的肿瘤组织中低表达。Circ KIF20B表达与肿瘤大小、TNM分期及分化程度呈负相关。4.敲减circ KIF20B会上调CDK4蛋白表达、下调BAX蛋白表达,同时增强细胞活力、增加吉非替尼IC50值、加速细胞周期进程、增强细胞增殖能力、抑制细胞凋亡;过表达circ KIF20B会下调CDK4蛋白表达、上调BAX蛋白表达,同时抑制细胞活力、减少吉非替尼IC50值、阻滞细胞周期进程、减弱细胞增殖能力、促进细胞凋亡。5.体内实验中,敲低circ KIF20B能促进非小细胞肺癌的发生发展,过表达circ KIF20B则会抑制肿瘤进程。6.证实了circ KIF20B与mi R-615-3p、mi R-615-3p与MEF2A的互作关系,明确了非小细胞肺癌中circ KIF20B/mi R-615-3p/MEF2A信号轴的存在。Mi R-615-3p在吉非替尼耐药患者的血清外泌体和非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中高表达;MEF2A在吉非替尼耐药患者的血清外泌体和非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中低表达。过表达mi R-615-3p或敲减MEF2A能够增加吉非替尼IC50值,敲低mi R-615-3p或过表达MEF2A能够减少吉非替尼IC50值。7.敲减的circ KIF20B增强了mi R-615-3p活性以抑制MEF2A表达,从而增强细胞活力、增加吉非替尼IC50值、加速细胞周期进程、增强细胞增殖能力、抑制细胞凋亡;过表达的Circ KIF20B抑制了mi R-615-3p活性以增强MEF2A表达,从而抑制细胞活力、减少吉非替尼IC50值、阻滞细胞周期进程、减弱细胞增殖能力、促进细胞凋亡。8.敲减的circ KIF20B增强了mi R-615-3p活性以抑制MEF2A表达,从而增加ATP含量、增强线粒体功能和氧化代谢水平;过表达的Circ KIF20B抑制了mi R-615-3p活性以增强MEF2A表达,从而减少ATP含量、削弱线粒体功能和氧化代谢水平。9.载有过表达circ KIF20B的外泌体能够靶向受体细胞,逆转受体细胞的吉非替尼耐药性,减弱细胞增殖能力、阻滞细胞周期和氧化代谢水平。【结论】本研究揭示了circ KIF20B/mi R-615-3p/MEF2A信号轴在参与调控非小细胞肺癌的吉非替尼耐药性和肿瘤进展的作用。外泌体circ KIF20B在非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药的早期筛查、检测和晚期治疗等方面有潜力成为重要的体液活检标志物和治疗靶点。