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实验目的 涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，约占全部涎腺肿瘤的9.95％，占涎腺恶性肿瘤的24％，平均为第二位的涎腺恶性肿瘤。涎腺腺样囊性癌好发于小涎腺及大涎腺中较小的腺体。绝大多数发生于头颈部，身体其它部位极其少见。根据WHO分类分为3种亚型：腺样（筛孔状）型、管状型和实质型。三种表现型可在同一肿瘤体中存在，类型的划分主要是根据上述成分所占的比重。涎腺组织内发生的腺样囊性癌大体上似与周围组织界限清楚，但剖面所见肿物无包膜，仔细审视可见其向周围组织浸润情况。少数病例亦有包膜，但常不完整。腺样囊性癌是一种侵袭性很强的肿瘤，常见包膜内、甚至包膜外都有癌细胞浸润。邻近肿瘤的组织如肌肉、骨及骨膜等，肉眼观察近似正常组织而镜检常见癌细胞浸润，因此很难确定肿瘤所累及的解剖范围。腺样囊性癌远处转移发生率较高，甚至早期就发生转移，主要转移部位是肺部。术后极易复发，治疗较困难，严重地危害患者的生命健康。控制复发和远处转移是临床治疗中的主要问题，而对涎腺腺样囊性癌肺转移的研究是学者们关注的热点。 蛋白激酶是酶类这个家族中重要的一员，被用来完成蛋白磷酸化作用的催化，这是控制细胞生命活动中最通常的机制，而其中最具有效性的蛋白激酶很可能就是CK2。蛋白激酶CK2是由两个分别为42-44KDa和38KDa的α或α′催化型亚基和两个28KDa的β调节型亚基组成ααββ、αα′ββ或α′α′ββ型异四聚体结构。该结构很稳定，在体外只有在变性的条件下才能被解离。调节型β亚基一般在活性的最佳表达和底物特性的最适合的调节方面发挥作用。迄今为止，蛋白激酶CK2已被发现具有160多种底物，这些底物涉及转录的调控、信号传导过程、生长调控、发育的各个步骤和细胞形态及结构的形成。除了细胞基质，一些病毒蛋白也被CKZ所磷酸化。蛋白激酶CKZ在转录、信号、增殖，而且在导致肿瘤发生的各细胞步骤中发挥作用。 蛋白激酶CK:可以磷酸化很多在细胞分裂和分化中起关键作用的底物，在肿瘤发生方面起重要作用。本实验应用免疫组化技术，对蛋白激酶CKZ一p（脚tein kinase CKZ一p，PKCKZ一p）在SACc中的表达进行研究，探讨蛋白激酶CK:一日在sACC中的表达意义。为了探讨蛋白激酶CK:一p与腺样囊性癌发生肺转移的关系，我们分别提取了sACC一LM及SACC一83两种细胞的细胞核和细胞质蛋白，对其中蛋白激酶C吸一p的活性和蛋白表达进行了检测，从而在蛋白水平揭示蛋白激酶cK:一p对涎腺腺样囊性癌发生肺转移的影响。nrn23一Hl基因是近年来较受人们关注的肿瘤转移抑制基因，它的异常表达与人类许多恶性肿瘤的转移有关，很多学者证实与涎腺腺样囊性癌的肺转移呈负相关。蛋白激酶C吮一p是否与涎腺腺样囊性癌的肺转移有关，目前尚未见相关报道。本实验首次应用蛋白激酶CKZ抑制剂DRB处理SACC一LM细胞，然后检测n.I23一H:的mRNA表达，从而探讨蛋白激酶CK:一p对涎腺腺样囊性癌肺转移的影响。实验方法 1.免疫组化 收集sACC标本45例，对照组正常涎腺组织12例。经两位病理学教授确诊并分类。将新鲜组织用10%中性福尔马林固定，制成5脚厚的石蜡切片。经水化，阻断内源性过氧化物酶活性，用免疫牛血清阻断非特异性抗原后，加抗PKC凡一p抗体，室温下孵育60而n，滴加生物素化二抗，再滴加链霉菌素抗生物素过氧化物酶复合物，室温下孵育10而n，各步骤之间均用缓冲液洗3次。DAB显色后加人苏木素复染。阴性对照省略第一抗体，用PBS缓冲液代替。 2.细胞培养与细胞周期同步化 sACC一哪及sACC一83细胞系（北京大学口腔学院口腔外科实验室提供），用DEME（d证beeeo’Smo翻eldE喀e’5 me击tnn）培养基加10%（v0UvOL）的56℃灭活的胎牛血清，滤膜除菌。细胞周期同步化在Gl期末用aphidicolin（DMSO溶成浓度为Zu岁d）。在培养瓶中指数生长期的细一<sup><sup><sup><sub><sub><sub><sub><sub><sub><sup>石<sup><sup>一一.一一.-翻一一一-<sup>一一*胞稀释至2.5 x 10，/己加人即hidicolin，终浓度为lug/血培养液，37℃C02培养箱中培养24小时后，用灭菌的PBS洗2次，后加人新鲜培养液。此时细胞停止在Gl/S期。 3.蛋白激酶C悦一日活性测定: 将处理后的细胞，PBS洗后加人100过细胞裂解液，成分为:EDTA（100mM）Zlnl，EGTA（100mM）10Inl，IM Tris一HCI（Pl][7 .5）Zml，Sueros8 .69，去离子水溶液定容100耐。超声粉碎后，12侧刃xg，4℃，2小时后离心，取上清备用。PKCK:一p反应体系:以〔A飞一A笔一Arg一以u一Glu一Glu一Thr一Clu一Glu一以u〕为底物，反应总体积为looul，含30mMTri扩HCIPE[7 .4，smMM邪几，15omM Nae犯，lmM击thiothreitol，0.05mM[，一’Zp]ATP，lmM底物37℃反应7分钟，取反应液25过点于whatlnan P81强阳离子交换滤纸（1 cm x Zcm）上，75ol磷酸溶液反复洗3次，最后将滤纸置于含10祖蒸馏水的液闪瓶中，用beck一man液闪仪测定cPm数。 蛋白定量用考马斯亮蓝测定法。 最后比活性为:cPm x 2.5 x 109/总放x7x蛋白量 4