继藻、虾、贝、鱼四次养殖浪潮之后，海参养殖成为我国北方海水养殖的新热点。2006年，山东、辽宁两省鲜海参总产量逾10万吨，总产值超100亿元。从海参的育苗、养殖，到海参产品的精深加工都掀起了一股巨大的投资热潮。然而养殖的过速发展和不规范运作造成了养殖刺参疾病大规模爆发。2002年起，山东辽宁两省养殖刺参不断发生疾病，造成巨大经济损失，严重影响了刺参养殖产业的健康持续发展。其中以“腐皮综合症”危害最为严重，造成刺参较高的死亡率。疾病快速诊断技术对于疾病防治具有重要意义，本文首次针对养殖刺参“腐皮综合症”主要致病菌灿烂弧菌、假交替单胞菌进行快速检测技术的研究。 以本实验室鉴定的刺参“腐皮综合症”两种主要致病菌灿烂弧菌(Vibrio splendidus，H1)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens，H2)为抗原，用不同混合比例的两种抗原免疫大白鼠，通过凝集反应与间接ELISA方法检测多克隆血清抗体的效价，结果表明H1与H2混合比例1：1与2：3制备的抗体效价变化并不明显，提示在制备二联兔多克隆抗体时，以这两种混合比例制备抗体较好。以灿烂弧菌H1、假交替单胞菌H2和混合抗原H1、H2制备兔抗血清KHl、KH2、二联多克隆抗体KH12，凝集反应测得三种抗血清效价均在1280以上，交叉反应较弱，能够应用于免疫快速检测。 以凹玻片为反应载体，建立了玻片直接凝集反应检测方法。反应体系中抗原25μL，抗体25μL；固定抗原反应浓度6×10<8>cells/mL，抗体稀释度以KHl 320，KH2 160，KHl2 160为最佳，在此稀释度下基本不发生交叉反应；20℃和37℃的反应温度对凝集反应速度影响并不显著，其反应灵敏度1.5×10<8>cells/mL。应用该方法对人工感染试验系统中水体、患病海参组织等培养出的优势菌进行检测，结果表明该方法可以检出各感染组相应病原菌。 在建立辣根过氧化酶标记细菌抗原的方法的基础上研究了双抗原夹心ELISA检测方法。反应条件为：最佳包被抗原浓度10<7>cells/mL；标记HRP-抗原稀释度100；抗血清工作浓度KH1 320、KH2 160、KH12 160。吸收试验与阻断试验结果均呈阴性；检测灵敏度1.87×10<4>cells/mL。对人工感染试验水体及患病海参组织培养菌进行了双抗原ELISA检测，凝集反应检测结果阳性的，双抗原ELISA检测结果也呈阳性。二联抗体可以同时对两种致病菌进行检测。建立了两种病原菌的Dot-ELISA检测方法。根据方正试验，确定检测用一抗、二抗最佳工作稀释度：灿烂弧菌抗血清稀释度320，酶标二抗稀释度3000；假交替单胞菌抗血清稀释度160，酶标二抗稀释度2000。阻断试验结果表明两种抗血清特异性均较高。灿烂弧菌抗血清在稀释度40与溶藻胶弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等弧菌发生微弱交叉反应，提高稀释度到160时，不发生交叉反应。假交替单胞菌抗血清基本不与常见海水致病弧菌发生交叉反应。人工感染试验检测结果表明该方法能从患病海参溃烂组织、未发病海参组织和感染水体检测到相应致病菌，检测灵敏度为9.4×10<3>+/mL。人工感染试验检测结果经直接凝集反应验证。该方法操作简便、灵敏度高，不需复杂仪器设备，适合在基层推广。 以载玻片为介质，建立了刺参“腐皮综合症”两种病原菌的间接荧光抗体检测技术。建立了荧光显微镜10个视野菌落数(400×)与已知浓度菌的关系曲线。通过关系曲线，未知养殖水体中特定病原菌检测时，根据荧光显微镜视野中菌数可以初步判断水体中致病菌数量。检测交叉反应菌，阻断试验，吸收试验结果表明本方法具有较高的特异性。通过二联抗体和抗血清分别对人工感染刺参进行检测，可以检出水体和溃烂部位相应病原菌，病原菌被染成特异性黄绿色，可检测到水体中2.4×10<4> cells/mL的菌量。但是经过样品浓缩处理，可以检测到低至8×10<2>cells/mL的病原菌。冰冻切片检测结果显示刺参嘴部肿胀与皮肤溃烂肌肉中含有大量致病菌。试验表明采用IFAT可以对刺参“腐皮综合症”两致病菌进行准确快速的检测，还可以用于养殖水体特定病原菌的数量监测。 在建立玻片直接凝集方法、双抗原夹心ELISA法、Dot-ELISA、间接荧光抗体技术等快速检测技术的基础上，对人工感染试验的感染水体、患病刺参溃烂肌肉、未患病海参肌肉以及空白对照组等样品不经过细菌培养，通过样品处理浓缩，直接用进行快速检测。结果显示：采取样品浓缩方式进行快速检测，阳性检出率比细菌培养检出率低。玻片凝集、双抗原ELISA、Dot-ELISA、间接荧光抗体检测人工感染试验阳性检出率分别是10％、72％、88.9％、83.3％。检测时间，样品浓缩处理约2h，检测时间均控制在6h以内。玻片凝集与Dot-ELISA适合现场检测推广，双抗原夹心ELISA法适合试验室检测，而IFAT适应于养殖水体的特定致病菌的数量检测以及病原菌侵袭某些组织的状况研究。