第一部分河北道地药材紫菀指纹图谱研究紫菀为双子叶菊科植物紫菀(Aster tataricus L. f.)的干燥根及根茎。具有润肺下气,消痰止咳的功效。紫菀中含有的三萜类成分(紫菀酮、木栓酮、表木栓醇等)为发挥药效的主要物质,且紫菀酮为其祛痰的有效成分之一。河北省为紫菀药材的主要产区,安国产紫菀药材素有“祁紫菀”之称。由于受地理因素和生长环境的影响,不同产区紫菀的化学成分及其含量不尽相同,紫菀酮的含量随地区的不同差异很大。目的:建立河北道地药材紫菀的HPLC指纹图谱,得到对照图谱,并与不同产地紫菀药材指纹特征相比较,计算相似度;并对其有效成分紫菀酮进行含量测定,为科学评价与有效控制紫菀药材质量提供新方法。方法:1指纹图谱研究(1)提取:比较了不同提取溶剂、不同提取方法及不同提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取率较高的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱、检测器及检测波长,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中紫菀酮色谱峰的分离度和理论板数。(4)精密度试验:制备样品溶液1份,重复进样6次,记录保留时间和峰面积。(5)重复性试验:平行制备样品溶液6份,分别进样,记录保留时间和峰面积。(6)稳定性试验:制备样品溶液1份,分别于0,2,4,6,8,12,24 h进样,记录保留时间和峰面积。(7)指纹图谱的建立:分别取道地紫菀药材10批,其他不同产地的紫菀样品7批,制备样品溶液,进行指纹图谱分析、相似度评价。2紫菀酮的含量测定(1)提取:同指纹图谱项下。(2)色谱条件:在指纹图谱色谱条件的基础上,改变流动相配比,使待测物峰在较短的时间内达到较好的分离。(3)系统适用性试验:在以上色谱条件下,对样品溶液进行HPLC检测,记录紫菀酮色谱峰的理论板数和分离度。(4)标准曲线的制备:配制系列浓度的紫菀酮对照品溶液,分别进样,记录峰面积;以紫菀酮的浓度为纵坐标,相应的峰面积为横坐标,绘制标准曲线。(5)精密度试验:制备样品溶液1份,重复进样6次,记录峰面积。(6)重复性试验:取同一批药材,平行制备样品溶液6份,分别进样,记录峰面积。(7)稳定性试验:制备样品溶液1份,分别于0,2,4,6,8,12,24 h进样,记录峰面积。(8)回收率试验:取已知紫菀酮含量的紫菀药材适量(约含紫菀酮为含量项下的50%)6份,分别加入适量的紫菀酮对照品溶液,平行制备同一浓度的样品,测定紫菀酮的含量。(9)检测限的确定:将紫菀酮对照品溶液逐步稀释,信噪比S/N≥3时的进样量确定为检测限。(10)样品测定:在已确定的色谱条件下,测定17批紫菀药材中紫菀酮的含量。结果:1指纹图谱研究(1)提取:甲醇超声提取20 min,重复性好,提取效率高。(2)色谱条件:色谱柱为DiamonsilTM C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温为30?C,检测波长为200 nm,进样体积为20μL。(3)系统适用性试验:在以上色谱条件下,紫菀酮的保留时间约为84 min,按紫菀酮色谱峰计算理论板数约为3.0×103,与其他色谱峰的分离度大于1.5。(4)精密度试验:以紫菀酮为内参照峰,计算各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD分别为0.11%～1.3%和0.18%～1.5%;利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件计算,相似度均大于0.9,说明精密度良好。(5)重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD分别为0.12%～1.1%和0.31%～2.9%,相似度均大于0.9,说明重复性良好。(6)稳定性试验:各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值分别为0.19%～1.7%和0.29%～2.1%,相似度均大于0.9,说明样品溶液在24 h内稳定。(7)指纹图谱的建立:得到10批道地紫菀药材的指纹图谱及其20个共有峰,同时得到不同来源紫菀药材的指纹图谱。(8)数据分析:运用相似度评价系统2004A版软件计算,10批河北道地药材相似度均在0.95以上,批间差异较小,春秋两季采收无明显差异。但不同产地的药材与河北道地药材生成的对照指纹图谱相比,相似度相差较大。2紫菀酮的含量测定(1)提取:同指纹图谱项下。(2)色谱条件:流动相为乙腈,流速为2.0 mL/min,其他条件同指纹图谱项下。(3)系统适用性试验:在以上色谱条件下,紫菀酮的理论板数为9.8×103,分离度大于1.5。(4)标准曲线的制备:紫菀酮浓度在0.099～0.895 mg/mL范围内呈良好的线性关系,回归方程分别为Y=2.500×10-3+9.800×10-8X,r=0.9996(n=5)。(5)精密度试验:紫菀酮含量的RSD值为1.4%,说明精密度良好。(6)重复性试验:紫菀酮含量的RSD值为3.0%,说明重复性良好。(7)稳定性试验:24 h内紫菀酮含量的RSD为0.66%,说明样品溶液在24 h内稳定。(8)回收率试验:紫菀酮的平均回收率为99.27%,RSD值为1.1%。(9)紫菀酮的检测限为1 ng。(10)含量测定:不同来源紫菀药材中紫菀酮的含量为0～0.3880%。结论:本文对来自不同产地的17批紫菀样品进行了HPLC-UV指纹图谱分析,以10批道地药材生成对照指纹图谱,对7批不同产地的紫菀进行了指纹图谱研究。同时对所收集紫菀样品中紫菀酮的含量进行了HPLC-UV测定,方法重复性和精密度良好,有助于紫菀药材的标准化种植与道地药材的质量控制,同时为紫菀药材的鉴别提供新的依据。第二部分河北道地药材远志指纹图谱研究远志为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志Polygala sibirica L.的干燥根,有安神益智,祛痰,消肿的功效。远志皂苷是远志的主要成分,本实验首次针对皂苷类成分,建立了远志药材的HPLC-ELSD指纹图谱。此外,远志中还含有酮类、寡糖脂类成分,采用HPLC-UV的方法,对远志药材中尽可能多的化学成分进行指纹图谱研究。以河北和中国药品生物制品检定所的远志药材图谱生成对照图谱,与山西、陕西等来自不同产地的9批样品进行比较。目的:建立河北道地药材远志的HPLC-ELSD和HPLC-UV指纹图谱,分别得到对照图谱,并与不同产地药材指纹图谱相比较,为控制远志药材的质量提供新的依据。方法:1 HPLC-ELSD指纹图谱研究(1)提取:针对远志皂苷类成分比较了不同提取溶剂、不同提取方法及不同提取时间的提取效果,选择能充分体现皂苷类成分的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱及检测器,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中各色谱峰的分离度和理论板数。(4)精密度试验:制备样品溶液1份,重复进样6次,记录保留时间和峰面积。(5)重复性试验:取同一批远志药材,平行制备样品溶液6份,分别进样,记录保留时间和峰面积。(6)稳定性试验:制备样品溶液1份,分别于0,2,4,6,8,12,24 h进样,记录保留时间和峰面积。(7)指纹图谱的建立:分别取道地远志药材10批,其他不同产地样品9批,制备样品溶液,进行指纹图谱分析。2 HPLC-UV指纹图谱研究(1)提取:比较了不同提取溶剂、不同提取方法及不同提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取率高的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱及检测器,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中各峰的分离度和理论板数。(4)精密度试验:制备样品溶液1份,重复进样6次,记录保留时间和峰面积。(5)重复性试验:取同一批药材,平行制备样品溶液6份,分别进样,记录保留时间和峰面积。(6)稳定性试验:制备样品溶液1份,分别于0,2,4,6,8,12,24 h进样,记录保留时间和峰面积。(7)指纹图谱的建立:分别取道地远志药材10批,其他不同产地的远志9批,制备样品溶液,进行指纹图谱分析。结果:1 HPLC-ELSD指纹图谱研究(1)提取:75%甲醇超声提取20 min,方法简便、快捷、稳定。(2)色谱条件:色谱柱为DiamonsilTM C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);乙腈-0.2%甲酸为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min;柱温为30?C;ELSD检测器,氮气流速为25 psi,漂移管温度为65?C,雾化器温度为36?C,增益值为350;进样体积20μL。(3)系统适用性试验:在以上色谱条件下,各峰理论板数均大于6.0×103,除未达到基线分离的两峰合并外,其余各峰分离度均大于1.2。(4)精密度试验:以指定内参照峰为基准,计算各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积比值的RSD分别为0.09%～2.0%和0.15%～2.5%;利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件计算,相似度均大于0.9,说明精密度良好。(5)重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积比值的RSD分别为0.16%～2.7%和0.31%～2.9%,相似度均大于0.9,说明重复性良好。(6)稳定性试验:各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积比值的RSD分别为0.10%～1.3%和0.29%～2.3%,相似度均大于0.9,说明样品溶液在24 h内稳定。(7)指纹图谱的建立:得到10批道地远志药材的HPLC-ELSD指纹图谱,生成对照指纹图谱,同时得到不同来源远志药材的指纹图谱。(8)数据分析:运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件和Excel表计算相似度,不同方法所得结果趋于一致,10批道地药材相似度均在0.85以上,9批不同产地药材中山西、陕西产远志相似度也在0.85以上,河北与两地所产远志无明显差异。内蒙产远志化学成分含量较低或有成分缺失,相似度较低。2 HPLC-UV指纹图谱研究(1)提取:75%甲醇超声提取20 min,方法稳定提取效率高。(2)色谱条件:色谱柱为DiamonsilTM C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);乙腈-0.2%甲酸为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min;柱温为30?C;Waters 2487检测器,检测波长316 nm;进样体积为20μL。(3)系统适用性试验:在以上色谱条件下,各峰理论板数均大于2.8×103,除未达到基线分离的两峰合并外,其余各峰分离度均大于1.0。(4)精密度试验:以指定内参照峰为基准,计算各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积比值的RSD分别为0.07%～1.7%和0.13%～1.6%;利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件计算,相似度均大于0.9,说明精密度良好。(5)重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积比值的RSD分别为0.15%～2.5%和0.29%～2.7%,相似度均大于0.9,说明重复性良好。(6)稳定性试验:各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积比值的RSD分别为0.08%～1.5%和0.21%～2.0%,相似度均大于0.9,说明样品溶液在24 h内稳定。(7)指纹图谱的建立:得到10批道地远志药材的指纹图谱,生成对照指纹图谱,同时得到不同来源远志药材的指纹图谱。(8)数据分析:运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件和Excel表计算相似度,结果趋于一致,10批道地药材相似度均在0.85以上,9批不同产地药材中山西、陕西产远志相似度也在0.85以上,甘草制远志相似度也较高,内蒙产远志化学成分含量较低或有成分的缺失,导致相似度较低。结论:本文首次建立了河北道地药材远志皂苷类成分的HPLC-ELSD指纹图谱,得到其对照图谱;同时建立了HPLC-UV指纹图谱,得到对照图谱,并分别与不同产地的远志样品进行了指纹图谱分析;分别运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件和Excel表计算相似度,对不同产地远志间的差异进行了研究,对远志药材进行了综合评价,方法重复性和精密度良好,有助于远志药材的标准化种植及远志道地药材的质量控制。第三部分河北道地药材板蓝根指纹图谱研究板蓝根(Radix isatidis)为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根,具有清热解毒、凉血利咽之功效。主要化学成分为有机酸类、氨基酸、生物碱类化合物。本研究根据板蓝根化学成分极性的不同将其分为水溶性和脂溶性两部分进行。本文对来自不同产地的20批板蓝根样品进行了水溶性和脂溶性的HPLC-UV指纹图谱分析,同时进行了靛蓝、靛玉红的含量测定,结合指纹图谱研究,对板蓝根的质量进行了综合评价,有助于板蓝根药材的标准化种植与道地药材的质量控制。目的:建立河北道地药材板蓝根水溶性和脂溶性两部分的指纹图谱,得到两部分的对照图谱,分别与不同产地板蓝根药材指纹特征相比较,并结合有效成分靛蓝、靛玉红的含量,为全面控制板蓝根药材的质量提供新的依据。方法:1水溶性部分指纹图谱研究(1)提取:以水为提取溶剂比较了不同提取时间的提取效果,选择提取率较高,重复性好的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中各色谱峰的分离度和理论板数。(4)精密度试验:制备样品溶液1份,重复进样6次,记录保留时间和峰面积。(5)重复性试验:取同一批板蓝根,平行制备样品溶液6份,分别进样,记录保留时间和峰面积。(6)稳定性试验:制备样品溶液1份,分别于0,2,4,6,8,12,24 h进样,记录保留时间和峰面积。(7)指纹图谱的建立:分别取河北道地板蓝根药材10批,其他不同产地的样品10批,制备样品溶液,进行指纹图谱分析。2脂溶性部分指纹图谱研究(1)提取:比较回流、索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果,并比较酸水提取、氨水碱化后提取、氯仿直接提取的方法,同时还考察不同提取时间的提取效果,选择提取率较高,重复性好的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中靛蓝、靛玉红的分离度和理论板数。(4)精密度试验:制备样品溶液1份,重复进样6次,记录保留时间和峰面积。(5)重复性试验:取同一批板蓝根样品,平行制备样品溶液6份,分别进样,记录保留时间和峰面积。(6)稳定性试验:制备样品溶液1份,分别于0,2,4,6,8,12,24 h进样,记录保留时间和峰面积。(7)指纹图谱的建立:分别取河北道地板蓝根药材10批,其他不同产地的样品10批,制备样品溶液,进行指纹图谱分析。3靛蓝、靛玉红的含量测定(1)提取:同“脂溶性部分指纹图谱”项下。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱及检测波长,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使待测峰在尽可能短的时间达到较好的分离。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察靛蓝、靛玉红的分离度和理论板数。(4)标准曲线的制备:配制系列浓度的靛蓝、靛玉红对照品溶液,分别进样,记录峰面积;分别以靛蓝、靛玉红的浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。(5)精密度试验:制备样品溶液1份,重复进样6次,记录对照品峰面积。(6)重复性试验:取同一批板蓝根样品,平行制备样品溶液6份,分别进样,记录对照品峰面积。(7)稳定性试验:制备样品溶液1份,分别于0,2,4,6,8,12,24 h进样,记录对照品峰面积。(8)回收率试验:取已知靛蓝、靛玉红含量的板蓝根药材适量(含靛蓝、靛玉红约为含量项下的50%)6份,分别加入适量的靛蓝、靛玉红对照品溶液,平行制备同一浓度的溶液6份,测定靛蓝、靛玉红的含量。(9)检测限的确定:分别将靛蓝、靛玉红对照品溶液逐步稀释,信噪比S/N≥3时的进样量确定为检测限。(10)样品测定:在已确定的色谱条件下,测定20批板蓝根药材中靛蓝、靛玉红的含量。结果:1水溶性部分指纹图谱研究(1)提取:以水超声提取20 min为佳,方法简便、快速、稳定。(2)色谱条件:色谱柱为DiamonsilTM C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温为30?C,UV检测器,检测波长为260 nm,进样体积20μL。(3)系统适用性试验:在以上色谱条件下,所有色谱峰均达到基线分离,各色谱峰理论板数均大于2.7×103,色谱峰分离度均大于1.2。(4)精密度试验:以指定内参照峰为基准,计算各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值,其RSD值分别为0.09%～1.8%和0.15%～2.5%;利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件计算相似度,结果均大于0.9,说明精密度良好。(5)重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值分别为0.17%～2.1%和0.29%～2.9%,相似度均大于0.9,说明重复性良好。(6)稳定性试验:各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD分别为0.11%～1.5%和0.17%～2.3%,相似度均大于0.9,说明样品溶液在24 h内稳定。(7)指纹图谱的建立:得到10批道地板蓝根药材水溶性部分的指纹图谱,生成对照指纹图谱,同时得到10批不同来源板蓝根药材的指纹图谱。(8)数据分析:运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行分析,20批板蓝根水溶性部分指纹图谱相似度均在0.850以上。2脂溶性部分指纹图谱研究(1)提取:氯仿回流提取5 h,各色谱峰的响应值不再增加,且方法简便,稳定。(2)色谱条件:色谱柱为DiamonsilTM C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);乙腈-0.05%磷酸为流动相梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温为30?C,UV检测器,检测波长为300 nm,进样体积为20μL。(3)系统适用性试验:在以上色谱条件下,理论板数按靛蓝、靛玉红的色谱峰计算分别为8.3×103、1.2×104,分离度均大于1.5。(4)精密度试验:以靛玉红为内参照峰计算各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值,其RSD值分别为0.25%～2.0%和0.58%～2.9%;利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件计算相似度,结果均大于0.9,说明精密度良好。(5)重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值分别为0.22%～2.1%和0.76%～3.0%,相似度均大于0.9,说明重复性良好。(6)稳定性试验:各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值的RSD分别为0.19%～2.0%和0.31%～2.4%;相似度均大于0.9,说明样品溶液在24 h内稳定。(7)指纹图谱的建立:得到10批道地板蓝根药材脂溶性部分的指纹图谱,生成对照指纹图谱,同时得到10批不同来源板蓝根药材的指纹图谱。(8)数据分析:运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行分析,10批河北产板蓝根药材相似度较高,而其他产地板蓝根由于有成分缺失现象,相似度相差较大。3靛蓝、靛玉红的含量测定(1)提取:同“脂溶性部分指纹图谱”项下。(2)色谱条件:在“脂溶性部分指纹图谱”色谱条件的基础上,改变流动相配比,使待测物峰在较短的时间内达到较好的分离。(3)系统适用性试验:在以上色谱条件下,理论板数按靛蓝、靛玉红的色谱峰计算分别为3.3×103、3.8×103,分离度分别为6.15、2.78。(4)标准曲线的制备:靛蓝、靛玉红浓度分别在0.1488～9.520μg/mL,0.2539～16.25μg/mL范围内呈良好的线性关系,回归方程分别为Y靛蓝=8.646×104X+1.219×104 ( r=0.9999 , n=7 ); Y靛玉红=8.568×104X+3.146×104(r=0.9995,n=7)。(5)精密度试验:靛蓝、靛玉红含量的RSD值分别为1.0%、0.79%,说明精密度良好。(6)重复性试验:靛蓝、靛玉红含量的RSD分别为1.6%、1.6%,说明重复性良好。(7)稳定性试验:24 h内靛蓝、靛玉红含量的RSD值分别为1.7%、1.3%,说明样品溶液在24 h内稳定。(8)回收率试验:靛蓝、靛玉红的平均回收率分别为97.8%、98.5%,RSD值分别为1.7%、1.6%。(9)靛蓝、靛玉红的检测限分别为2 ng、3 ng。(10)含量测定结果:不同来源板蓝根药材中靛蓝的含量为0.0459～4.095μg/g,靛玉红的含量为6.250～0.0522μg/g。结论:本文首次研究了板蓝根样品水溶性和脂溶性两部分的色谱指纹图谱,以10批道地药材生成对照指纹图谱,与不同产地的板蓝根药材指纹图谱进行相似度比较,并结合有效成分靛蓝、靛玉红的含量最终确定板蓝根药材的质量。该方法重复性和精密度良好,有助于板蓝根药材的标准化种植与道地药材的质量控制,同时为该药材的鉴别提供新的依据。