论文部分内容阅读
背景:心力衰竭(Heart failure,HF)是严重威胁全球人类健康的重大疾病之一,急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)是导致心力衰竭发生的最主要原因之一,如何减少急性心梗后缺血心肌的凋亡,保护梗死区周围正常和缺血心肌,延缓心室重构,改善心脏功能是目前心血管疾病研究的重大课题。近年来,研究发现心肌梗死后NLRP3炎症小体调控的炎症反应是诱导心肌凋亡、心肌纤维化,促进心室重构发生的主要原因。因此,如何有效的控制心梗后的心肌炎症反应,抑制炎性细胞因子对心肌的损害,可能是治疗心梗后不良心室重构的有效措施。NLRP3炎症小体作为先天免疫系统的组成部分,是一种大分子蛋白复合物,能够精确调节caspase-1的激活以及IL-1β和IL-18等强力促炎细胞因子的产生和分泌。研究发现MCC950是NLRP3炎症小体特异性抑制剂,能够特异性抑制NLRP3炎症小体激活,降低炎症因子IL-18及IL-1β分泌。因此,本研究主要探讨MCC950对小鼠心肌梗死后心功能保护及心室重构的影响,阐明MCC950的具体作用机制,为改善患者心肌梗死后的临床预后,减轻心肌纤维化,改善心室重构提供新的治疗策略。第一部分NLRP3炎症小体在小鼠心肌梗死中的作用目的:观察NLRP3炎症小体在小鼠心肌梗死中的作用方法:选择6-8周的C57/B6雄性小鼠,随机分为2组:假手术组(SHAM组),心肌梗死组(MI组)。分别在1d、3d、7d和14d检测小鼠血清中IL-18及IL-1β含量。Western blot及RT-PCR检测相关炎症因子NLRP3、Cleaved IL-18和Cleaved IL-1β的含量。结果:(1)与SHAM组相比,MI组小鼠血清中IL-18及IL-1β含量显著增高,差异均有统计学意义(p<0.05),与MI组相比,小鼠3d、7d血清中IL-18(p<0.05)及IL-1β(p<0.05)含量显著增高,且在3d达到峰值。(2)Western blot及RT-PCR结果显示,与SHAM组相比,MI组心肌中NLRP3、Cleaved IL-18和Cleaved IL-1β含量明显增高,差异均有统计学意义(p<0.05),与MI组相比,小鼠3d及7d心肌中NLRP3(p<0.05)、Cleaved IL-18(p<0.05)及Cleaved IL-1β(p<0.05)含量显著增高,且在3d达到峰值。小结:(1)小鼠心肌梗死后诱导心肌炎症反应,分泌大量的炎症因子NLRP3、IL-18及IL-1β。(2)炎症相关蛋白NLRP3、Cleaved IL-18和Cleaved IL-1β在小鼠心肌内含量先增高后下降,且在3d内达到峰值。第二部分MCC950对小鼠心肌梗死后心功能及心室重构的影响及机制研究目的:观察MCC950对小鼠心肌梗死后心功能及心室重构的影响,并探讨其作用机制。方法:选择6-8周的C57/B6小鼠,随机分为3组:假手术组(SHAM组),心肌梗死组(MI组)和心肌梗死+MCC950治疗组(MI+MCC950组)。小鼠心脏彩超检测心功能相关指标:左心室射血分数(Left Ventricular Ejection Fraction,LVEF)、左室缩短分数(Left Ventricular Fractional Shortening,LVFS)、心排出量(Cardiac Output,CO)及心率(Heart Rate,HR)。检测小鼠血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)水平,HE染色观察心肌炎症浸润程度及组织形态学变化,Masson染色观察心肌纤维化程度,Western blot及RT-PCR检测心肌中纤维化相关蛋白Collagen-I、Collagen-III和αSMA及炎症相关蛋白NLRP3、Cleaved caspase-1、Cleaved IL-18和Cleaved IL-1β的含量。结果:(1)超声心动图检测了小鼠心功能:与SHAM组相比,MI组和MI+MCC950组的HR无明显差异,无统计学意义(p>0.05)。与SHAM组相比,MI组小鼠心功能损害加重,LVEF(p<0.05)和LVFS(p<0.05)均显著降低,与MI组相比,MI+MCC950组心功能得到显著的改善,LVEF和LVFS均显著增高,统计学均有意义(p<0.05)。(2)与SHAM组相比,MI组小鼠血清中CK-MB及LDH均显著增高,差异有统计学意义(p<0.05),与MI组相比,MI+MCC950组血清中CK-MB(p<0.05)及LDH(p<0.05)明显降低。(3)Masson染色结果显示,与SHAM组相比,MI组小鼠心肌纤维化程度明显加重(p<0.05),与MI组相比,MI+MCC950组心肌纤维化水平减低,差异有统计学意义(p<0.05)。Western blot及RT-PCR检测心肌中纤维化相关蛋白Collagen-I、Collagen-III和αSMA结果进一步证实,与SHAM组相比,MI组小鼠心肌纤维化程度加重,而与MI组相比,MI+MCC950组心肌纤维化程度减轻,差异均有统计学意义(p均<0.05)。(4)HE染色结果显示,与SHAM组相比,MI组小鼠心肌内炎症细胞浸润明显增高,差异有统计学意义(p<0.05),与MI组相比,MI+MCC950组炎症细胞浸润显著减少,差异有统计学意义(p<0.05)。免疫组化结果表明,MCC950能抑制巨噬细胞CD68、中性粒细胞Ly6G及T淋巴细胞CD4浸润。免疫荧光结果进一步证明,MCC950能显著减少NLRP3炎症小体浸润。(5)Western blot及RT-PCR结果显示,与SHAM组相比,MI组炎症相关蛋白NLRP3(p<0.05)、Cleaved caspase-1(p<0.05)、Cleaved IL-18(p<0.05)和Cleaved IL-1β(p<0.05)显著增高,而与MI组相比,MI+MCC950组心肌内NLRP3、Cleaved caspase-1、Cleaved IL-18和Cleaved IL-1β含量明显减少,差异均有统计学意义(p均<0.05)。小结:(1)MCC950可以改善小鼠心梗后心功能,降低血清心肌酶学水平,减少心肌梗死面积,减轻心肌纤维化,进而改善不良心室重构。(2)MCC950能特异性抑制小鼠心梗后血清及心肌内NLRP3炎症小体表达,进而抑制caspase-1、IL-18和IL-1β表达,减轻心肌炎症反应。(3)MCC950通过NLRP3-IL-1β信号通路介导发挥抗炎作用以保护心梗后心功能,改善心室重构。第三部分MCC950对乳鼠成纤维细胞缺氧损伤的作用及机制研究目的:构建小鼠乳鼠成纤维细胞缺氧损伤模型,观察MCC950在细胞水平的作用,进一步印证MCC950的作用机制。方法:(1)培养1-3天的C57/B6乳鼠的原代成纤维细胞,设定不同时间点(0h、6h、12h、18h、24h及36h)的缺氧损伤模型,Western blot检测成纤维细胞中NLRP3、Pro-IL-1β及Cleaved IL-1β的表达。(2)乳鼠的原代成纤维细胞,构建缺氧损伤模型,给予不同浓度的MCC950(1,10,20,40μM)治疗后,CCK-8检测细胞活力,Western blot检测原代成纤维细胞中纤维化相关蛋白Collagen-I、Collagen-III和αSMA表达,测定成纤维细胞上清液中炎症因子IL-18及IL-1β的分泌,免疫荧光共定位检测细胞中NLRP3的表达,Western blot检测炎症相关蛋白NLRP3、Cleaved caspase-1、Cleaved IL-18和Cleaved IL-1β的含量。结果:(1)Western blot结果显示,与缺氧0h相比,缺氧18h后成纤维细胞中的NLRP3及Cleaved IL-1β中的表达显著升高,差异有统计学意义(p<0.05),说明缺氧18h后,成纤维细胞中NLRP3和Cleaved IL-1β激活最明显,因此之后的成纤维细胞的缺氧时间为18h。(2)CCK-8检测结果显示,与SHAM组相比,缺氧18h后成纤维细胞活力明显下降,差异有统计学意义(p<0.05),与缺氧18h相比,MCC950治疗后细胞活力增高,尤其是10μM的MCC950治疗后,细胞活力显著增高,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)与SHAM组相比,缺氧18h后心肌纤维化蛋白Collagen-I(p<0.05)和αSMA(p<0.05)表达量明显升高,与缺氧18h相比,MCC950(10μM)治疗组Collagen-I和αSMA表达量显著降低,差异均有统计学意义(p均<0.05)。(4)与SHAM组相比,缺氧18h后细胞上清中NLRP3(p<0.05)、IL-18(p<0.05)及IL-1β(p<0.05)分泌明显增加,与缺氧18h相比,MCC950(10μM)治疗组细胞上清中NLRP3、IL-18及IL-1β表达量减少,差异均有统计学意义(p均<0.05)。(5)免疫荧光共定位结果说明,与SHAM组相比,缺氧18h后成纤维细胞中NLRP3的表达量显著升高,差异有统计学意义(p<0.05),与缺氧18h相比,MCC950(10μM)治疗组NLRP3表达量明显下降,差异有统计学意义(p<0.05)。Western blot结果表明,与SHAM组相比,缺氧18h后NLRP3(p<0.05)、Cleaved caspase-1(p<0.05)、Cleaved IL-18(p<0.05)和Cleaved IL-1β(p<0.05)表达量明显增高,与缺氧18h相比,MCC950(10μM)治疗组成纤维细胞内NLRP3、Cleaved caspase-1、Cleaved IL-18和Cleaved IL-1β表达量降低,差异均有统计学意义(p均<0.05)。小结:(1)成纤维细胞缺氧18h后,细胞活力下降,心肌纤维化程度明显加重,予以MCC950治疗后,细胞活力明显上升,心肌纤维化程度减轻,进一步印证MCC950能改善细胞活力,减轻心肌纤维化。(2)成纤维细胞缺氧18h后,NLRP3和Cleaved IL-1β的表达量显著增高,予以MCC950治疗后,成纤维细胞中NLRP3、Cleaved caspase-1、Cleaved IL-18和Cleaved IL-1β的含量明显降低,进一步印证MCC950通过NLRP3-IL-1β信号通路发挥作用心肌保护作用,改善心室重构。