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黄芪是黑龙江省极具发展和应用前景的大宗林下药用植物资源,通常以3-5年所采收的干燥根入药,由于多年的滥采滥挖,黑龙江省的野生黄芪资源已濒临灭绝,而黄芪栽培种的品质退化以及皂苷和异黄酮类有效成分含量易受环境变化和病虫害等影响,已造成它们质量下降和临床治疗效果不佳等不良后果。利用植物组织培养技术生产药用次生代谢活性成分并阐明其生物合成机制,现已成为现代林业生物制剂和森林植物次生代谢工程研究的重要内容。本研究优化并建立了一个高效快速的黄芪毛状根体外诱导体系,系统筛选出了高产皂苷和异黄酮类活性成分的毛状根株系,并通过PCR分析实现对其分子鉴定。同时利用相关数理统计实验设计和动力学模型,系统优化了黄芪毛状根的液体培养条件,并对其中皂苷和异黄酮次生代谢活性成分进行了LC-MS/MS定性和定量分析检测。通过外源理化和生物诱导子胁迫处理黄芪毛状根培养体系,利用LC-MS/MS技术分析诱导处理前后黄芪毛状根中皂苷和异黄酮类活性成分含量的变化规律,并结合qRT-PCR技术分析诱导处理前后黄芪毛状根中皂苷和异黄酮生物合成酶基因的表达差异性规律,最终初步阐明黄芪中皂苷和异黄酮类次生代谢活性成分生物合成路径中的关键调控酶基因。本论文的主要研究内容及结果如下：1、优化黄芪毛状根培养体系高效生产皂苷和异黄酮类次生代谢活性成分(1)选取3周龄黄芪无菌苗叶片作为外植体,经发根农杆菌LBA9402侵染后在含有100μM乙酰丁香酮浓度的MS培养基上共培养2天,然后转移到含500 mg/L头孢噻肟钠浓度的抑菌培养基中培养,最终能够达到66.84%的毛状根诱导率,而且整个诱导周期只需13天。以毛状根生长量和次生代谢活性成分积累量为考察指标,筛选得到高产皂苷的毛状根株系AMHRL Ⅵ和高产异黄酮的毛状根株系AMHRL Ⅱ,并进行了PCR分子鉴定。(2)利用CCD实验设计和Slogistic动力学模型对高产皂苷的黄芪毛状根株系AMHRLVⅥ液体培养条件进行了系统的优化,得到最佳液体培养条件如下：培养温度27.8℃,接种量1.54%,蔗糖浓度3.24%和培养时间36天。利用BBD实验设计对高产异黄酮的黄芪毛状根株系AMHRL Ⅱ液体培养条件进行了系统的优化,得到最佳液体培养条件如下：培养温度27.8℃,接种量1.44%,蔗糖浓度3.39%和培养时间34天。利用LC-MS/MS对黄芪毛状根中的6种皂苷类单体成分和5种异黄酮类单体成分进行了定性和定量分析。在最佳培养条件下,黄芪毛状根培养体系中总皂苷(2.657±0.088 mg/g DW)和总异黄酮(234.77土4.27μg/g DW)产率,明显高于3年生栽培黄芪中的总皂苷(2.435±0.093 mg/g DW)和总异黄酮产率(187.38土7.25 gg/g DW)。2、植物信号分子对黄芪毛状根培养体系中皂苷和异黄酮生物合成的诱导调控(1)利用茉莉酸甲酯(MJ)、乙酰水杨酸(ASA)和水杨酸(SA)信号分子对黄芪毛状根中皂苷和异黄酮类次生代谢活性成分的生物合成进行了诱导调控。诱导实验策略结果表明MJ对生长处于平台期的黄芪毛状根(34日龄)中次生代谢活性成分的生物合成诱导效果最佳。利用CCD实验设计优化并确定了最佳MJ诱导条件。MJ诱导增强34日龄黄芪毛状根培养体系Ⅵ生产皂苷的最佳条件为：MJ浓度157.4μM和诱导时间18.4 h。在此条件下总皂苷得率为5.547±0.133 mg/g DW,是未处理空白对照组中总皂苷得率(2.685±0.051mg/gDW)的2.07倍。MJ诱导增强34日龄黄芪毛状根培养体系Ⅱ生产异黄酮的最佳条件为：MJ浓度283 μM和诱导时间33.75 h。在此条件下总异黄酮得率为2250.10±71.88μg/gDW,是未处理空白对照组中总异黄酮得率(231.64±6.51μg/g DW)的9.71倍。(2)通过qRT-PCR分析皂苷和异黄酮生物合成路径中19个酶基因的转录表达水平,并结合LC-MS/MS分析皂苷和异黄酮类活性成分含量的变化规律,初步阐明了MJ诱导调控皂苷和异黄酮生物合成路径中的关键酶基因。实验结果表明MVD、IDI、FPS和SS是MJ诱导调控黄芪皂苷生物合成路径中的关键酶基因；CHI和IFS是MJ诱导调控黄芪异黄酮生物合成路径中的关键酶基因。此外,MJ诱导后黄芪毛状根培养体系中抗氧化酶的活力以及提取物的抗氧化活性显著增强,确定了黄芪毛状根对MJ诱导表现出了显著的氧化应激防御响应。3、UV辐射对黄芪毛状根培养体系中皂苷和异黄酮生物合成的诱导调控(1)利用UV-A、UV-B和UV-C对黄芪毛状根中皂苷和异黄酮类次生代谢活性成分的生物合成进行了诱导调控,实验结果表明UV-B对这两种次生代谢活性成分的生物合成诱导调控效果最好。UV-B诱导32日龄黄芪毛状根培养体系Ⅵ生产皂苷的最佳辐射剂量为54 kJ/m2,在此条件下总皂苷得率为3.431±0.092 mg/g DW,是未处理空白对照组中总皂苷得率(2.645±0.073 mg/g DW)的1.30倍。UV-B诱导增强34日龄黄芪毛状根培养体系Ⅱ中异黄酮积累的最佳辐射剂量为86.4 kJ/m2,此条件下总异黄酮得率为533.54±13.61μg/g DW,是未处理空白对照组中总异黄酮得率(232.93±3.08μg/g DW)的2.29倍。(2)利用qRT-PCR分析了黄芪皂苷和异黄酮生物合成路径中19个酶基因的转录表达水平,并结合LC-MS/MS分析皂苷和异黄酮类活性成分含量的变化规律,初步阐明了UV-B诱导调控黄芪皂苷和异黄酮生物合成路径中的关键酶基因。实验结果表明HMGR是UV-B诱导调控黄芪皂苷生物合成路径中唯一的关键酶基因;PAL和C4H是UV-B诱导调控黄芪异黄酮生物合成路径中的两个关键酶基因。此外,UV-B诱导后黄芪毛状根培养体系中抗氧化酶的活力以及提取物的抗氧化活性显著增强,确定了黄芪毛状根对UV-B诱导表现出了显著的氧化应激防御响应。4、真菌生物转化和生物诱导双重作用促进黄芪毛状根培养体系中黄芪甲苷的富集(1)基于课题组首次分离出来的一株可产脱乙酰化酶的灰变青霉属真菌Penicillium canescens,本研究构建了海藻酸钙固定化的P. canescens孢子小球(IPC)和黄芪毛状根共培养体系,一方面利用IPC所具有的脱乙酰化作用将一些低活性的黄芪甲苷前体衍生物(黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和异黄芪皂苷Ⅱ)转化为高活性的黄芪甲苷,另一方面利用其生物诱导效应进一步增强黄芪毛状根中黄芪甲苷和异黄酮类活性成分的合成与积累。(2)IPC在黄芪毛状根培养体系Ⅵ中脱乙酰生物转化的最佳条件为：固定化孢子量为105个/瓶、共培养温度30℃、pH 7.0和共培养时间60 h。在此条件下,黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和异黄芪皂苷Ⅱ几乎能够完全转化为黄芪甲苷。同时,IPC还能够显著诱导大部分皂苷生物合成酶基因(AACT、HMGS、HMGR、MK、FPS、SS、SE和CAS)转录表达水平上调。在IPC脱乙酰化生物转化及其生物诱导双重作用之下,黄芪甲苷得率(2.816±0.052 mgg/g DW)相对于未处理空白对照组(0.193±0.007 mg/gDW)增加了14.59倍。此外,IPC处理的黄芪毛状根中总异黄酮得率为673.21土10.75μg/g DW,是未处理空白对照组中总异黄酮得率(236.97±3.50μg/g DW)的2.84倍。IPC同样能够显著诱导异黄酮生物合成酶基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHR、CHI、IFS和13’H)转录表达水平上调。IPC还具有优异的稳定性,能够在60天贮存周期内保持其脱乙酰化活性和生物诱导效果稳定。此外,IPC在重复使用6次之后仍能保持良好的脱乙酰化活性和生物诱导效果,为后续利用该技术手段工业化生产黄芪甲苷奠定了坚实的基础。皂苷和异黄酮类化合物不仅仅是植物次生代谢活性成分,还可以作为植保素用以提高植物的抗逆性,确定它们生物合成路径中的关键酶,为未来利用分子育种来改良和培育新的抗性药用植物品种,或利用植物次生代谢工程技术手段高效生产药用活性成分,都具有重要的意义!