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动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)性心血管疾病是严重威胁人类健康的一大类疾病，是世界范围内主要死亡原因之一，其防治是当前医学研究领域的重要课题。AS的发病机制十分复杂，主要包括内皮细胞损伤、脂质浸润以及炎症介质分泌等机制，最终引起大、中动脉管壁上形成大量斑块。其中巨噬细胞摄取脂质并转化为泡沫细胞以及炎症反应是AS起始的关键事件。因此，研究抑制泡沫细胞形成和减少炎症反的机制应对于As的防治具有重要意义。
三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1, ABCA1)是一种细胞膜结合蛋白，以ATP为能源促进细胞内胆固醇流出至载脂蛋白A-1(apolipoprotein, apoA-1)，最终形成高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)，抑制泡沫细胞形成。研究显示，上调巨噬细胞ABCA1表达，能够促进胆固醇流出，抑制泡沫细胞形成，降低炎症反应，减少AS斑块面积，提示ABCA1是抑制泡沫细胞形成和减低炎症反应的关键蛋白，能有效防治AS发生发展。新近研究显示，ABCA1蛋白半衰期较短，稳定性较低，容易通过泛素化途径发生蛋白降解。因此，寻找抑制ABCA1蛋白降解的机制，对于抑制泡沫细胞形成和减少炎症反应具有重要意义。
载脂蛋白A-1结合蛋白(apoA-1 binding protein, AIBP)是一种能与apoA-1结合的分泌蛋白。近年来，大量研究发现，AIBP与心血管疾病发生发展相关。研究证实，缺血性心脏病患者心肌组织中AIBP高表达；AIBP能抑制家族性混合性高血脂症等脂质代谢紊乱疾病的发生发展；深静脉血栓患者血小板内AIBP含量增加，抑制血栓形成；AIBP还可以调节人脐静脉内皮细胞和斑马鱼胚胎胆固醇水平，抑制血管内皮生长因子诱导的血管新生，提示AIBP可能是心血管疾病防治的一个新靶点。因此，研究AIBP对ABCA1介导的胆固醇流出、炎症反应及AS的发生发展的影响及机制具有重要意义。
AIBP结合apoA-1发挥其生物功能的具体结构和氨基酸位点尚未阐明。生物信息学研究显示，AIBP蛋白的115-123号氨基酸(CGPGNNGGD)可能是其与apoA-1结合的位点，且位于AIBP独特的Yje_N结构域中的Rossmann样折叠区域内，提示AIBP蛋白115-123号氨基酸可能是与apoA-1结合，发挥相应生物学效应的重要位点。因此，研究AIBP和缺失115-123号氨基酸的AIBP(AIBP(Δ115-123))对巨噬细胞胆固醇流出、ABCA1表达、ABCA1泛素化降解、炎症反应和apoE-/-小鼠AS发生发展的影响及可能机制。
第一部分AIBP对THP-1源性泡沫细胞形成的作用及机制
目的：观察AIBP对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的影响，研究AIBP对泡沫细胞形成的影响和潜在机制。
方法：培养THP-1细胞，与160nmol/L的佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)共孵育12小时，诱导其分化为巨噬细胞。用50μg/ml的氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)处理THP-1源性巨噬细胞48小时，使其吞噬脂质，大量荷脂形成THP-1源性泡沫细胞。构建AIBP表达载体，分离纯化AIBP蛋白，用不同浓度(0、0.05、0.1、0.2和0.4μg/ml)的AIBP和25μg/mlapoA-1共孵育THP-1源性泡沫细胞24h；0.2μg/mlAIBP和25μg/mlapoA-1处理THP-1源性泡沫细胞不同时间(0、6、12、24和48小时)后，经液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出至apoA-1的水平。用0.2μg/mlAIBP和25μg/ml去除apoB脂蛋白的人血清孵育THP-1源性巨噬细胞，液体闪烁计数仪检测胆固醇流出情况。从健康人体血液中分离原代单核细胞，用25μg/mlapoA-1和0.2μg/mlAIBP共孵育人原代巨噬细胞，液体闪烁计数仪检测胆固醇流出情况。25μg/mlapoA-1和0.2μg/mlAIBP共孵育THP-1源性泡沫细胞，油红O染色检测泡沫细胞形成情况；高效液相色谱检测细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯水平；qPCR和Westernblot方法分别检测ABCA1mRNA和蛋白水平。生物信息学分析AIBP与apoA-1结合位点。构建AIBP(Δ115-123)表达载体，并纯化蛋白。生物素标记apoA-1(biotin-labeled apoA-1, b-apoA-1)，检测AIBP和AIBP(Δ115-123)对b-apoA-1与巨噬细胞结合的影响。免疫共沉淀检测AIBP和AIBP(Δ115-123)对apoA-1与ABCA1的结合情况。
结果：液体闪烁计数仪检测显示，AIBP和apoA-1呈时间和剂量依赖性促进THP-1源性泡沫细胞内ABCA1介导的胆固醇流出。在缺乏apoA-1的作用下，AIBP不影响THP-1源性泡沫细胞的胆固醇流出。去除人血清中的apoB蛋白，与AIBP共孵育THP-1源性泡沫细胞，显著促进细胞内ABCA1介导的胆固醇流出。AIBP和apoA-1同样促进人原代巨噬细胞内ABCA1介导的胆固醇流出。qPCR和Westernblot方法检测发现，AIBP上调ABCA1蛋白水平，但不影响ABCA1mRNA表达。油红O染色和高效液相色谱分析显示，AIBP和apoA-1显著抑制泡沫细胞形成，降低细胞内游离胆固醇和胆固醇酯等脂质水平。生物信息学预测发现，AIBP的115-123号氨基酸可能是其与apoA-1结合的重要位点。酶标仪和免疫共沉淀检测发现AIBP促进b-apoA-1与巨噬细胞膜结合，促进apoA-1与ABCA1结合；而AIBP(Δ115-123)不影响apoA-1与巨噬细胞膜及ABCA1结合。
小结：①AIBP上调ABCA1蛋白水平，促进apoA-1与巨噬细胞膜及ABCA1蛋白结合，增加ABCA1介导的胆固醇流出，抑制THP-1源性泡沫细胞形成。②AIBP的115-123号氨基酸是其与apoA-1结合的重要位点。
第二部分AIBP对ABCA1蛋白稳定性的作用及机制
目的：研究AIBP不影响ABCA1mRNA但上调其蛋白水平的可能机制。
方法：用25μg/mlapoA-1和0.2μg/mlAIBP或AIBP(Δ115-123)与THP-1源性巨噬细胞共孵育24小时，随后加入20μg/ml放线菌素(cycloheximide, CHX)处理1小时，抑制细胞内所有基因转录，分别在处理后0、0.5、1、2和4小时提取总蛋白，Westernblot检测ABCA1蛋白水平，研究AIBP对ABCA1蛋白的稳定性的影响。4℃下用sulfo-SS-biotin标记THP-1源性泡沫细胞，用抗生素链霉菌素-琼脂糖(streptavidin-agarose)吸附生物素标记的蛋白，分别在0、5、10、30、60和120分钟洗脱，经Westernblot方法检测ABCA1蛋白含量，检测ABCA1蛋白从细胞膜上脱落进入细胞内的量。免疫共沉淀检测ABCA1蛋白泛素化水平。THP-1源性巨噬细胞与0.1μM的硼替佐米(bortezomib)共孵育4小时，抑制蛋白泛素化降解，免疫共沉淀方法检测ABCA1蛋白泛素化水平，Westernblot方法检测ABCA1蛋白表达量，液体闪烁计数仪检测ABCA1介导的胆固醇流出水平。免疫共沉淀检测ABCA1蛋白与CSN2蛋白的结合水平。THP-1源性巨噬细胞内转染CSN2siRNA后，Westernblot检测CSN2干扰效果，免疫共沉淀检测ABCA1蛋白泛素化水平，qPCR和Westernblot方法分别检测ABCA1mRNA和蛋白表达水平，液体闪烁计数仪检测ABCA1介导的胆固醇流出水平。
结果：CHX抑制蛋白转录后，不同时间点检测ABCA1蛋白水平，发现AIBP显著稳定ABCA1蛋白。AIBP显著抑制ABCA1蛋白从细胞膜上脱落进入细胞内，稳定ABCA1在细胞膜上。免疫共沉淀研究发现，AIBP处理下，ABCA1蛋白泛素化水平显著降低。硼替佐米抑制蛋白泛素化降解后，免疫共沉淀、Westernblot和液体闪烁计数检测发现，AIBP不影响ABCA1蛋白泛素化水平、ABCA1蛋白水平和ABCA1介导的胆固醇流出。免疫共沉淀研究发现，AIBP抑制ABCA1蛋白与CSN2相互作用。用siRNA成功干扰THP-1源性巨噬细胞CSN2蛋白后，AIBP不影响ABCA1蛋白泛素化水平、ABCA1mRNA和蛋白表达及ABCA1介导的胆固醇流出。与AIBP组相比，AIBP(Δ115-123)不影响ABCA1蛋白稳定性、泛素化水平及其介导的胆固醇流出能力。
小结：①AIBP稳定ABCA1蛋白在细胞膜上，减少ABCA1蛋白经CSN2介导的泛素化降解。②AIBP的115-123号氨基酸是AIBP稳定ABCA1蛋白的结构基础。
第三部分AIBP对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子分泌的作用及机制
目的：探讨AIBP是否影响LPS诱导的THP-1源性巨噬细胞炎症反应及可能机制。
方法：用100ng/mlLPS、25μg/mlapoA-1和0.2μg/mlAIBP或AIBP(Δ115-123)共孵育THP-1源性巨噬细胞16小时。qPCR和Elisa分别检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等促炎因子的mRNA表达和分泌；提取细胞质蛋白和细胞核蛋白，Westernblot方法检测NF-κBp65含量，研究AIBP对NF-κB核转位及活化的影响。Westernblot方法检测ERK1/2、JNK1/2和p-38等促分裂元激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)蛋白磷酸化水平，qPCR检测MyD88mRNA表达情况。15μMNF-κB抑制剂小白菊内酯(parthenolide)共孵育THP-1源性巨噬细胞1小时，qPCR和Elisa分别检测IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等促炎因子mRNA表达和蛋白分泌。qPCR和Westernblot检测TLR4mRNA和蛋白表达情况。提取细胞膜蛋白，Westernblot检测细胞膜上TLR4蛋白水平。免疫荧光染色检测细胞毒素B(cholera toxin B, CTB)标记的脂筏含量。不连续梯度离心法分离脂筏，Westernblot检测脂筏中TLR4和小凹蛋白1(caveolin 1, CAV1)的含量。THP-1源性巨噬细胞转染ABCA1siRNA，Westernblot检测ABCA1蛋白，qPCR和Elisa检测IL-6和MCP-1mRNA和蛋白的表达量。
结果：qPCR和Elisa检测发现，AIBP显著抑制LPS诱导的THP-1源性巨噬细胞内IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等促炎因子mRNA表达和蛋白分泌。Westernblot检测细胞质和细胞核内NF-κBp65含量发现，AIBP显著减少细胞核内磷酸化的p65，抑制NF-κB核转位。AIBP降低THP-1源性巨噬细胞内MyD88mRNA表达，抑制ERK1/2、JNK1/2和p38等MAPKs蛋白磷酸化。小白菊内酯抑制NF-κB活性后，AIBP不影响细胞核内磷酸化的NF-κB含量，不影响NF-κB核转位；AIBP不影响IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等促炎因子mRNA表达和蛋白分泌。qPCR和Westernblot检测证实，AIBP不影响TLR4mRNA和蛋白表达。分离细胞膜蛋白，Westernblot检测证实AIBP减少THP-1源性巨噬细胞膜上的TLR4含量。荧光显微镜下观察发现，AIBP减少THP-1源性巨噬细胞脂筏含量。密度梯度离心分离脂筏发现，AIBP显著减少TLR4在细胞膜脂筏处的含量。siRNA成功干扰ABCA1表达后，AIBP不影响IL-6和MCP-1等促炎因子的mRNA表达和蛋白分泌。与AIBP组相比，AIBP(Δ115-123)不影响TLR4/MyD88/MAPKs/NF-κB信号通路及其介导的促炎因子表达和分泌。
小结：①AIBP以ABCA1依赖的方式，减少TLR4在细胞脂筏上含量，通过MyD88/MAPKs/NF-κB通路降低促炎因子表达和分泌，抑制LPS诱导的THP-1源性巨噬细胞炎症反应。②AIBP的115-123号氨基酸是AIBP抑制THP-1源性巨噬细胞炎症反应的结构基础。
第四部分AIBP对apoE-/-小鼠AS病变的影响及机制
目的：以apoE基因敲除(apoE-/-)小鼠为研究对象，探讨AIBP对apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇流出、巨噬细胞浸润和迁移、炎症因子表达、胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT)及AS发生发展的影响及机制。
方法：雄性8周龄apoE-/-小鼠随机分为对照组、AIBP组和AIBP(Δ115-123)组，分别转染重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)、rAAV-AIBP和rAAV-AIBP(Δ115-123)。每组随机选取三只喂养普通饮食。其余apoE-/-小鼠喂养高脂/高胆固醇饮食，随后在第4、8和12周，分别随机选取3只，提取主动脉和腹腔巨噬细胞(mouse peritoneal macrophages, MPMs)，经Westernblot检测人AIBP和AIBP(Δ115-123)基因过表达情况。普通饮食组apoE-/-小鼠喂养4周后安乐死处死，高脂/高胆固醇饮食小鼠饲养12周，每隔一周对对其进行称重。高效液相色谱检测高脂/高胆固醇喂养的apoE-/-小鼠MPMs细胞内TC、FC和CE含量。提取各组小鼠血液，分离血清，化学发光发法检测血清谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)水平。提取高脂/高胆固醇喂养12周的apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞，与100ng/mlLPS共孵育16小时，qPCR和Elisa方法检测IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的mRNA表达和蛋白分泌水平。提取MPMs细胞质和细胞核蛋白，Westernblot检测NF-κB水平，研究AIBP对NF-κB核转位影响。分离高脂/高胆固醇喂养下各组apoE-/-小鼠主动脉，qPCR检测MCP1、CXCL1、CXCL2、ICAM-1和VCAM-1等趋化相关因子的表达。Transwell方法检测AIBP对MPMs迁移能力的影响。主动脉窦冰冻切片，免疫荧光染色检测CD68标记的巨噬细胞浸润情况。qPCR检测M2型巨噬细胞标志物MHC-II以及M1型巨噬细胞标志物Mrc-1表达水平。腹腔注射含[3H]胆固醇的J774巨噬细胞，检测血液、肝脏和粪便中的放射含量，研究胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT)效率。分离各组小鼠主动脉弓，体视显微镜经下观察主动脉弓处AS斑块面积。纵向剖开整条主动脉(从主动脉弓到髂总动脉分支处)，油红O染色观察主动脉内脂质蓄积情况。分别用HE、masson和油红O染色检测主动脉窦冰冻切片AS斑块面积、胶原含量和脂质蓄积情况。
结果：高脂高胆固醇饮食喂养的第4、8和12周，Westernblot检测发现，人AIBP和AIBP(Δ115-123)成功稳定表达于apoE-/-小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞中。化学发光法检测证实过表达人AIBP和AIBP(Δ115-123)不影响ALT、AST和ALP水平，不影响肝脏对脂质的代谢功能。AIBP上调普通饮食和高脂/高胆固醇喂养的apoE-/-小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞内ABCA1蛋白表达，不影响ABCA1mRNA水平，促进ABCA1介导的胆固醇流出。HPLC检测证实，AIBP降低高脂饮食apoE-/-小鼠MPMs细胞中TC、FC和CE含量。AIBP抑制LPS诱导下MPMs细胞IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等促炎因子mRNA表达和蛋白分泌，抑制NF-κB核转位。AIBP降低apoE-/-主动脉内MCP1、CXCL1、CXCL2、ICAM-1和VCAM-1等趋化相关因子的mRNA表达，降低MPMs迁移能力，抑制AS斑块内CD68标记的巨噬细胞浸润，上调M2型巨噬细胞标记物MHC-II表达，下调M1型巨噬细胞标志物Mrc-1表达。过表达人AIBP和AIBP(Δ115-123)不影响apoE-/-小鼠体重，增加apoE-/-小鼠血浆内HDL-c含量，促进RCT。AIBP减少主动脉弓处斑块面积，抑制主动脉内脂质蓄积，减少主动脉窦内AS斑块面积和脂质蓄积，增加AS斑块内胶原含量，稳定斑块，抑制AS的发生。而AIBP(Δ115-123)不影响ABCA1蛋白含量、ABCA1介导的胆固醇流出、炎症、RCT、脂质蓄积、AS斑块形成和稳定性，不影响apoE-/-小鼠AS发生发展。
小结：①AIBP上调ABCA1蛋白，促进ABCA1介导的胆固醇流出，增加血液中HDL-c含量，促进RCT，抑制apoE-/-小鼠AS的发生发展。②AIBP下调apoE-/-小鼠促炎因子和趋化相关因子的表达和分泌，降低巨噬细胞迁移能力，抑制巨噬细胞浸润，减少炎症反应。
结论
1.AIBP上调ABCA1蛋白水平，促进apoA-1与巨噬细胞膜及ABCA1蛋白结合，增加ABCA1介导的胆固醇流出，抑制泡沫细胞形成。
2.AIBP稳定ABCA1蛋白在细胞膜上，减少ABCA1蛋白经CSN2介导的泛素化降解。
3.AIBP以ABCA1依赖的方式，减少TLR4在细胞脂筏上含量，通过MyD88/MAPKs/NF-κB通路降低促炎因子表达和分泌，抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。
4.AIBP促进RCT，降低炎症反应，抑制apoE-/-小鼠AS的发生发展。
5.AIBP的115-123号氨基酸是其与apoA-1结合的重要位点，是AIBP发挥生物学功能的结构基础。
三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1, ABCA1)是一种细胞膜结合蛋白，以ATP为能源促进细胞内胆固醇流出至载脂蛋白A-1(apolipoprotein, apoA-1)，最终形成高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)，抑制泡沫细胞形成。研究显示，上调巨噬细胞ABCA1表达，能够促进胆固醇流出，抑制泡沫细胞形成，降低炎症反应，减少AS斑块面积，提示ABCA1是抑制泡沫细胞形成和减低炎症反应的关键蛋白，能有效防治AS发生发展。新近研究显示，ABCA1蛋白半衰期较短，稳定性较低，容易通过泛素化途径发生蛋白降解。因此，寻找抑制ABCA1蛋白降解的机制，对于抑制泡沫细胞形成和减少炎症反应具有重要意义。
载脂蛋白A-1结合蛋白(apoA-1 binding protein, AIBP)是一种能与apoA-1结合的分泌蛋白。近年来，大量研究发现，AIBP与心血管疾病发生发展相关。研究证实，缺血性心脏病患者心肌组织中AIBP高表达；AIBP能抑制家族性混合性高血脂症等脂质代谢紊乱疾病的发生发展；深静脉血栓患者血小板内AIBP含量增加，抑制血栓形成；AIBP还可以调节人脐静脉内皮细胞和斑马鱼胚胎胆固醇水平，抑制血管内皮生长因子诱导的血管新生，提示AIBP可能是心血管疾病防治的一个新靶点。因此，研究AIBP对ABCA1介导的胆固醇流出、炎症反应及AS的发生发展的影响及机制具有重要意义。
AIBP结合apoA-1发挥其生物功能的具体结构和氨基酸位点尚未阐明。生物信息学研究显示，AIBP蛋白的115-123号氨基酸(CGPGNNGGD)可能是其与apoA-1结合的位点，且位于AIBP独特的Yje_N结构域中的Rossmann样折叠区域内，提示AIBP蛋白115-123号氨基酸可能是与apoA-1结合，发挥相应生物学效应的重要位点。因此，研究AIBP和缺失115-123号氨基酸的AIBP(AIBP(Δ115-123))对巨噬细胞胆固醇流出、ABCA1表达、ABCA1泛素化降解、炎症反应和apoE-/-小鼠AS发生发展的影响及可能机制。
第一部分AIBP对THP-1源性泡沫细胞形成的作用及机制
目的：观察AIBP对THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的影响，研究AIBP对泡沫细胞形成的影响和潜在机制。
方法：培养THP-1细胞，与160nmol/L的佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)共孵育12小时，诱导其分化为巨噬细胞。用50μg/ml的氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)处理THP-1源性巨噬细胞48小时，使其吞噬脂质，大量荷脂形成THP-1源性泡沫细胞。构建AIBP表达载体，分离纯化AIBP蛋白，用不同浓度(0、0.05、0.1、0.2和0.4μg/ml)的AIBP和25μg/mlapoA-1共孵育THP-1源性泡沫细胞24h；0.2μg/mlAIBP和25μg/mlapoA-1处理THP-1源性泡沫细胞不同时间(0、6、12、24和48小时)后，经液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出至apoA-1的水平。用0.2μg/mlAIBP和25μg/ml去除apoB脂蛋白的人血清孵育THP-1源性巨噬细胞，液体闪烁计数仪检测胆固醇流出情况。从健康人体血液中分离原代单核细胞，用25μg/mlapoA-1和0.2μg/mlAIBP共孵育人原代巨噬细胞，液体闪烁计数仪检测胆固醇流出情况。25μg/mlapoA-1和0.2μg/mlAIBP共孵育THP-1源性泡沫细胞，油红O染色检测泡沫细胞形成情况；高效液相色谱检测细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯水平；qPCR和Westernblot方法分别检测ABCA1mRNA和蛋白水平。生物信息学分析AIBP与apoA-1结合位点。构建AIBP(Δ115-123)表达载体，并纯化蛋白。生物素标记apoA-1(biotin-labeled apoA-1, b-apoA-1)，检测AIBP和AIBP(Δ115-123)对b-apoA-1与巨噬细胞结合的影响。免疫共沉淀检测AIBP和AIBP(Δ115-123)对apoA-1与ABCA1的结合情况。
结果：液体闪烁计数仪检测显示，AIBP和apoA-1呈时间和剂量依赖性促进THP-1源性泡沫细胞内ABCA1介导的胆固醇流出。在缺乏apoA-1的作用下，AIBP不影响THP-1源性泡沫细胞的胆固醇流出。去除人血清中的apoB蛋白，与AIBP共孵育THP-1源性泡沫细胞，显著促进细胞内ABCA1介导的胆固醇流出。AIBP和apoA-1同样促进人原代巨噬细胞内ABCA1介导的胆固醇流出。qPCR和Westernblot方法检测发现，AIBP上调ABCA1蛋白水平，但不影响ABCA1mRNA表达。油红O染色和高效液相色谱分析显示，AIBP和apoA-1显著抑制泡沫细胞形成，降低细胞内游离胆固醇和胆固醇酯等脂质水平。生物信息学预测发现，AIBP的115-123号氨基酸可能是其与apoA-1结合的重要位点。酶标仪和免疫共沉淀检测发现AIBP促进b-apoA-1与巨噬细胞膜结合，促进apoA-1与ABCA1结合；而AIBP(Δ115-123)不影响apoA-1与巨噬细胞膜及ABCA1结合。
小结：①AIBP上调ABCA1蛋白水平，促进apoA-1与巨噬细胞膜及ABCA1蛋白结合，增加ABCA1介导的胆固醇流出，抑制THP-1源性泡沫细胞形成。②AIBP的115-123号氨基酸是其与apoA-1结合的重要位点。
第二部分AIBP对ABCA1蛋白稳定性的作用及机制
目的：研究AIBP不影响ABCA1mRNA但上调其蛋白水平的可能机制。
方法：用25μg/mlapoA-1和0.2μg/mlAIBP或AIBP(Δ115-123)与THP-1源性巨噬细胞共孵育24小时，随后加入20μg/ml放线菌素(cycloheximide, CHX)处理1小时，抑制细胞内所有基因转录，分别在处理后0、0.5、1、2和4小时提取总蛋白，Westernblot检测ABCA1蛋白水平，研究AIBP对ABCA1蛋白的稳定性的影响。4℃下用sulfo-SS-biotin标记THP-1源性泡沫细胞，用抗生素链霉菌素-琼脂糖(streptavidin-agarose)吸附生物素标记的蛋白，分别在0、5、10、30、60和120分钟洗脱，经Westernblot方法检测ABCA1蛋白含量，检测ABCA1蛋白从细胞膜上脱落进入细胞内的量。免疫共沉淀检测ABCA1蛋白泛素化水平。THP-1源性巨噬细胞与0.1μM的硼替佐米(bortezomib)共孵育4小时，抑制蛋白泛素化降解，免疫共沉淀方法检测ABCA1蛋白泛素化水平，Westernblot方法检测ABCA1蛋白表达量，液体闪烁计数仪检测ABCA1介导的胆固醇流出水平。免疫共沉淀检测ABCA1蛋白与CSN2蛋白的结合水平。THP-1源性巨噬细胞内转染CSN2siRNA后，Westernblot检测CSN2干扰效果，免疫共沉淀检测ABCA1蛋白泛素化水平，qPCR和Westernblot方法分别检测ABCA1mRNA和蛋白表达水平，液体闪烁计数仪检测ABCA1介导的胆固醇流出水平。
结果：CHX抑制蛋白转录后，不同时间点检测ABCA1蛋白水平，发现AIBP显著稳定ABCA1蛋白。AIBP显著抑制ABCA1蛋白从细胞膜上脱落进入细胞内，稳定ABCA1在细胞膜上。免疫共沉淀研究发现，AIBP处理下，ABCA1蛋白泛素化水平显著降低。硼替佐米抑制蛋白泛素化降解后，免疫共沉淀、Westernblot和液体闪烁计数检测发现，AIBP不影响ABCA1蛋白泛素化水平、ABCA1蛋白水平和ABCA1介导的胆固醇流出。免疫共沉淀研究发现，AIBP抑制ABCA1蛋白与CSN2相互作用。用siRNA成功干扰THP-1源性巨噬细胞CSN2蛋白后，AIBP不影响ABCA1蛋白泛素化水平、ABCA1mRNA和蛋白表达及ABCA1介导的胆固醇流出。与AIBP组相比，AIBP(Δ115-123)不影响ABCA1蛋白稳定性、泛素化水平及其介导的胆固醇流出能力。
小结：①AIBP稳定ABCA1蛋白在细胞膜上，减少ABCA1蛋白经CSN2介导的泛素化降解。②AIBP的115-123号氨基酸是AIBP稳定ABCA1蛋白的结构基础。
第三部分AIBP对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子分泌的作用及机制
目的：探讨AIBP是否影响LPS诱导的THP-1源性巨噬细胞炎症反应及可能机制。
方法：用100ng/mlLPS、25μg/mlapoA-1和0.2μg/mlAIBP或AIBP(Δ115-123)共孵育THP-1源性巨噬细胞16小时。qPCR和Elisa分别检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等促炎因子的mRNA表达和分泌；提取细胞质蛋白和细胞核蛋白，Westernblot方法检测NF-κBp65含量，研究AIBP对NF-κB核转位及活化的影响。Westernblot方法检测ERK1/2、JNK1/2和p-38等促分裂元激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)蛋白磷酸化水平，qPCR检测MyD88mRNA表达情况。15μMNF-κB抑制剂小白菊内酯(parthenolide)共孵育THP-1源性巨噬细胞1小时，qPCR和Elisa分别检测IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等促炎因子mRNA表达和蛋白分泌。qPCR和Westernblot检测TLR4mRNA和蛋白表达情况。提取细胞膜蛋白，Westernblot检测细胞膜上TLR4蛋白水平。免疫荧光染色检测细胞毒素B(cholera toxin B, CTB)标记的脂筏含量。不连续梯度离心法分离脂筏，Westernblot检测脂筏中TLR4和小凹蛋白1(caveolin 1, CAV1)的含量。THP-1源性巨噬细胞转染ABCA1siRNA，Westernblot检测ABCA1蛋白，qPCR和Elisa检测IL-6和MCP-1mRNA和蛋白的表达量。
结果：qPCR和Elisa检测发现，AIBP显著抑制LPS诱导的THP-1源性巨噬细胞内IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等促炎因子mRNA表达和蛋白分泌。Westernblot检测细胞质和细胞核内NF-κBp65含量发现，AIBP显著减少细胞核内磷酸化的p65，抑制NF-κB核转位。AIBP降低THP-1源性巨噬细胞内MyD88mRNA表达，抑制ERK1/2、JNK1/2和p38等MAPKs蛋白磷酸化。小白菊内酯抑制NF-κB活性后，AIBP不影响细胞核内磷酸化的NF-κB含量，不影响NF-κB核转位；AIBP不影响IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等促炎因子mRNA表达和蛋白分泌。qPCR和Westernblot检测证实，AIBP不影响TLR4mRNA和蛋白表达。分离细胞膜蛋白，Westernblot检测证实AIBP减少THP-1源性巨噬细胞膜上的TLR4含量。荧光显微镜下观察发现，AIBP减少THP-1源性巨噬细胞脂筏含量。密度梯度离心分离脂筏发现，AIBP显著减少TLR4在细胞膜脂筏处的含量。siRNA成功干扰ABCA1表达后，AIBP不影响IL-6和MCP-1等促炎因子的mRNA表达和蛋白分泌。与AIBP组相比，AIBP(Δ115-123)不影响TLR4/MyD88/MAPKs/NF-κB信号通路及其介导的促炎因子表达和分泌。
小结：①AIBP以ABCA1依赖的方式，减少TLR4在细胞脂筏上含量，通过MyD88/MAPKs/NF-κB通路降低促炎因子表达和分泌，抑制LPS诱导的THP-1源性巨噬细胞炎症反应。②AIBP的115-123号氨基酸是AIBP抑制THP-1源性巨噬细胞炎症反应的结构基础。
第四部分AIBP对apoE-/-小鼠AS病变的影响及机制
目的：以apoE基因敲除(apoE-/-)小鼠为研究对象，探讨AIBP对apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇流出、巨噬细胞浸润和迁移、炎症因子表达、胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT)及AS发生发展的影响及机制。
方法：雄性8周龄apoE-/-小鼠随机分为对照组、AIBP组和AIBP(Δ115-123)组，分别转染重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)、rAAV-AIBP和rAAV-AIBP(Δ115-123)。每组随机选取三只喂养普通饮食。其余apoE-/-小鼠喂养高脂/高胆固醇饮食，随后在第4、8和12周，分别随机选取3只，提取主动脉和腹腔巨噬细胞(mouse peritoneal macrophages, MPMs)，经Westernblot检测人AIBP和AIBP(Δ115-123)基因过表达情况。普通饮食组apoE-/-小鼠喂养4周后安乐死处死，高脂/高胆固醇饮食小鼠饲养12周，每隔一周对对其进行称重。高效液相色谱检测高脂/高胆固醇喂养的apoE-/-小鼠MPMs细胞内TC、FC和CE含量。提取各组小鼠血液，分离血清，化学发光发法检测血清谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)水平。提取高脂/高胆固醇喂养12周的apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞，与100ng/mlLPS共孵育16小时，qPCR和Elisa方法检测IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的mRNA表达和蛋白分泌水平。提取MPMs细胞质和细胞核蛋白，Westernblot检测NF-κB水平，研究AIBP对NF-κB核转位影响。分离高脂/高胆固醇喂养下各组apoE-/-小鼠主动脉，qPCR检测MCP1、CXCL1、CXCL2、ICAM-1和VCAM-1等趋化相关因子的表达。Transwell方法检测AIBP对MPMs迁移能力的影响。主动脉窦冰冻切片，免疫荧光染色检测CD68标记的巨噬细胞浸润情况。qPCR检测M2型巨噬细胞标志物MHC-II以及M1型巨噬细胞标志物Mrc-1表达水平。腹腔注射含[3H]胆固醇的J774巨噬细胞，检测血液、肝脏和粪便中的放射含量，研究胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT)效率。分离各组小鼠主动脉弓，体视显微镜经下观察主动脉弓处AS斑块面积。纵向剖开整条主动脉(从主动脉弓到髂总动脉分支处)，油红O染色观察主动脉内脂质蓄积情况。分别用HE、masson和油红O染色检测主动脉窦冰冻切片AS斑块面积、胶原含量和脂质蓄积情况。
结果：高脂高胆固醇饮食喂养的第4、8和12周，Westernblot检测发现，人AIBP和AIBP(Δ115-123)成功稳定表达于apoE-/-小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞中。化学发光法检测证实过表达人AIBP和AIBP(Δ115-123)不影响ALT、AST和ALP水平，不影响肝脏对脂质的代谢功能。AIBP上调普通饮食和高脂/高胆固醇喂养的apoE-/-小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞内ABCA1蛋白表达，不影响ABCA1mRNA水平，促进ABCA1介导的胆固醇流出。HPLC检测证实，AIBP降低高脂饮食apoE-/-小鼠MPMs细胞中TC、FC和CE含量。AIBP抑制LPS诱导下MPMs细胞IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等促炎因子mRNA表达和蛋白分泌，抑制NF-κB核转位。AIBP降低apoE-/-主动脉内MCP1、CXCL1、CXCL2、ICAM-1和VCAM-1等趋化相关因子的mRNA表达，降低MPMs迁移能力，抑制AS斑块内CD68标记的巨噬细胞浸润，上调M2型巨噬细胞标记物MHC-II表达，下调M1型巨噬细胞标志物Mrc-1表达。过表达人AIBP和AIBP(Δ115-123)不影响apoE-/-小鼠体重，增加apoE-/-小鼠血浆内HDL-c含量，促进RCT。AIBP减少主动脉弓处斑块面积，抑制主动脉内脂质蓄积，减少主动脉窦内AS斑块面积和脂质蓄积，增加AS斑块内胶原含量，稳定斑块，抑制AS的发生。而AIBP(Δ115-123)不影响ABCA1蛋白含量、ABCA1介导的胆固醇流出、炎症、RCT、脂质蓄积、AS斑块形成和稳定性，不影响apoE-/-小鼠AS发生发展。
小结：①AIBP上调ABCA1蛋白，促进ABCA1介导的胆固醇流出，增加血液中HDL-c含量，促进RCT，抑制apoE-/-小鼠AS的发生发展。②AIBP下调apoE-/-小鼠促炎因子和趋化相关因子的表达和分泌，降低巨噬细胞迁移能力，抑制巨噬细胞浸润，减少炎症反应。
结论
1.AIBP上调ABCA1蛋白水平，促进apoA-1与巨噬细胞膜及ABCA1蛋白结合，增加ABCA1介导的胆固醇流出，抑制泡沫细胞形成。
2.AIBP稳定ABCA1蛋白在细胞膜上，减少ABCA1蛋白经CSN2介导的泛素化降解。
3.AIBP以ABCA1依赖的方式，减少TLR4在细胞脂筏上含量，通过MyD88/MAPKs/NF-κB通路降低促炎因子表达和分泌，抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。
4.AIBP促进RCT，降低炎症反应，抑制apoE-/-小鼠AS的发生发展。
5.AIBP的115-123号氨基酸是其与apoA-1结合的重要位点，是AIBP发挥生物学功能的结构基础。