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目的:探索大鼠惊厥持续状态(Status Convulsion,SC)后癫痫发生不同时期海马内髓鞘相关抑制因子Nogo A,MAG,OMgp(MOG)及跨膜蛋白Lingo-1、Rho A的动态变化。方法:选用成年SD大鼠120只,分为正常对照组24只,实验组96只。实验组96只实验组采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导SC,在SC的不同时期,采用免疫荧光染色定位检测大鼠海马内Nogo A蛋白,MAG蛋白,OMgp蛋白,Rho A蛋白,Lingo-1蛋白的变化;western blot测定Nogo A蛋白,MAG蛋白,OMgp蛋白,Rho A蛋白,Lingo-1蛋白及p-Rho A蛋白含量的动态变化;RT-PCR检测海马内跨膜蛋白Lingo-1的m RNA的表达水平。结果:(1)髓鞘相关抑制因子的变化:大鼠海马内Nogo A蛋白,MAG蛋白,OMgp蛋白,在SC后癫痫发生的过程中均有升高,但呈现不同的时序性动态变化。MAG蛋白:在SC后5天表达增多(P<0.01),后缓慢下降,SC后20天、SC后60天时,与正常相比无统计学意义。western blot检查结果与免疫荧光检查略有不同,模型组在SC后5天、SC后20天时均高于正常表达(P<0.001,P<0.01),SC后60天降至正常。Nogo A蛋白:模型组在SC后1天、SC 5后天与正常组相比无明显变化,在SC后20天后升高(P<0.01),SC后60天与正常组相比无统计学差异。Western blot检查结果与免疫荧光检查结果一致。OMgp蛋白:模型组在SC后1天无明显升高,在SC后20天、SC后60天时升高(P<0.01,p<0.001)。Western blot检查结果与免疫荧光检查结果一致。(2)Lingo-1的检测模型组无论在蛋白还是在基因水平(m RNA)均呈现出SC后逐渐升高,在达高峰后逐渐下降。而基因先于蛋白表达。蛋白检测在SC后1天与正常无统计学差异,SC后5天高到高峰(p<0.001),在SC后20天逐渐下降(p<0.05),在SC后60天后降至正常;Lingo-1的半定量PCR,结果显示Lingo-1 m RNA在SC后1天,表达水平已经很快达到高峰(p<0.001),在SC后5天,SC后20天仍高于正常水平(p<0.001),而在SC后60天后未降至正常(3)Rho A:模型组与正常相比差别无统计学意义在SC后总Rho A的量无明显变化。磷酸化Rho A(p-Rho A)蛋白:在SC后很快升高SC后1天(P<0.001),SC后5天达高峰(P<0.001),在SC后20天(P<0.001)出现下降,SC后60天和正常组无统计学差异。结论:(1)SC后髓鞘相关轴突生长抑制因子变化的方向不完全相同,但它们在不同的时期均有升高,故它们作用合力与Rho A/ROCK信号通路上的磷酸化Rho A相关。(2)Lingo-1和磷酸化Rho A在SC发生后呈升高的趋势,在慢性期逐渐降低。SC后Lingo-1与p-Rho A的变化方向和时间点一致,提示Rho A的磷酸化很大程度上是由Lingo-1介导的,且在惊厥发生后Rho A/ROCK信号通路得以活化,可能最终导致神经元轴突生长锥的塌陷,进而使轴突功能受损。目的:在第一部分我们研究中发现SC后Lingo-1的基因与蛋白水平的表达均上调,且随SC后癫痫发生的时间延长逐渐下降。在本部分实验中,拟通过sh RNA片段转染来抑制Lingo-1蛋白的表达,明确病毒转染能否下调目标细胞和组织内Lingo-1的表达,为研究Lingo-1的奠定基础。方法:设计出三个不同的LV Lingo-1 sh RNA片段(SC+LV Lingo-1/sh RNA 3086,SC+LV Lingo-1/sh RNA 3087,SC+LV Lingo-1/sh RNA3088),使用GV118为载体,包装出实验所需LV Lingo-1/sh RNA片段。将设计得到的此三个LV Lingo-1/sh RNA片段分别通过转染细胞和动物两个层面进行验证。(1)在细胞层面:采用培养的C6细胞,转染LV Lingo-1/sh RNA,通过荧光表达和PCR验证Lingo-1表达的变化;(2)在动物层面:选用SD大鼠112只,其中阴性对照32只,分正常组,正常+慢病毒空病毒组,余80只建立SC模型,分为SC组,SC+空病毒组,SC+LV Lingo-1/sh RNA 3086,SC+LV Lingo-1/sh RNA 3087,SC+LV Lingo-1/sh RNA 3088共7组,每组16只。通过侧脑室立体定位将sh RNA片段注射到侧脑室(59天断头的大鼠则需在注射LV Lingo-1/sh RNA 30天后再次注射1次),在注射LV Lingo-1/sh RNA后第10天、59天处死动物,通过Western-blot了解海马Lingo-1蛋白的表达情况。结果:(1)在基因水平,所设计的三种LV Lingo-1/sh RNA能抑制体外培养C6细胞内Lingo-1的蛋白表达,抑制最明显的是LV Lingo-1/sh RNA是3087片段。(2)动物实验也可以发现,无论在注射第10天还是第59天,所设计的三种LV Lingo-1/sh RNA也能抑制Lingo-1蛋白的表达,也以LV Lingo-1/sh RNA 3087的抑制作用最明显。结论:所包装的LV Lingo-1/sh RNA片段能明确抑制Lingo-1的表达,以3087片段最为明显。目的:了解阻断SC动物海马Rho A的磷酸化或抑制Lingo-1的表达,对SC后大鼠惊厥易感性和认知功能的影响,及其病理基础。方法:60天SD大鼠采用氯化锂-皮罗卡品建立SC动物模型,分为LV Lingo-1/sh RNA干预组和盐酸法舒地尔(Fasudil hydrochloride,HF)干预组,LV Lingo-1/sh RNA干预组195只,HF干预组156只。LV Lingo-1/sh RNA干预组包括LV Lingo-1/sh RNA干预组及LV Lingo-1/sh RNA+HF干预组,在模型建立次日这两组通过立体定位仪定位侧脑室,每只大鼠通过侧脑室注射5μl LV Lingo-1/sh RNA,Lingo-1/sh RNA+HF干预组则同时在SC1天开始用HF腹腔注射(10 mg/kg×30天),两组均在侧脑室注射后30天再次注射同等剂量的LV Lingo-1/sh RNA;同时建立正常组,及正常+LV Lingo-1/sh RNA组作为阴性对照。HF干预组则在SC1天开始用HF腹腔注射(10 mg/kg×30天),同时设定正常组及正常+HF组作为阴性对照,在干预后59天(SC60天),通过水迷宫实验、新物体识别实验检测动物学习、认知功能;通过氯化锂-皮罗卡品再次诱发惊厥发作,了解大鼠惊厥易感性的变化;HE染色和尼氏染色,明确脑组织病理变化;通过Western-blot检测大鼠海马内组织MBP蛋白表达,了解不同处理后大鼠SC后髓鞘的变化。结果:(1)认知功能的变化:水迷宫实验显示:在第1天可见平台测试中,各组大鼠寻找平台的时间和寻找平台的距离没有统计学差异;第2-5天随着训练时间的延长,各组大鼠找到逃生平台所需的时间逐步缩短。第6天平台探索实验,(1)LV Lingo-1/sh RNA干预组:SC+Lingo-1/sh RNA干预组、SC+Lingo-1/sh RNA+HF干预组找到平台次数明显多于SC组,但是仍少于正常组,差异具有统计学意义(P<0.001,正常组vs.SC干预组;P<0.01,对照组vs.SC干预组,SC+Lingo-1/sh RNA干预组vs.SC干预组,SC+Lingo-1/sh RNA+HF干预组vs.SC干预组)。(2)HF干预组:SC+HF干预组找到平台次数明显多于SC干预组,差异具有统计学意义(P<0.05,正常组vs.SC组,对照组vs.SC干预组、HF干预组vs.SC干预组)。新事物识别实验提示:(1)LV Lingo-1/sh RNA干预组:通过新事物识别行为学实验,明确LV Lingo-1/sh RNA干预对SC模型大鼠新事物探索能力(用偏好指数表示:即新物体识别的时间/旧物体识别时间,同时将比值进行组间比较)的影响。SC组大鼠对新事物的探索能力明显低于正常组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05,SC组vs.正常组,SC组vs.阴性对照组)。而LV Lingo-1/sh RNA干预组及LV Lingo-1/sh RNA+HF干预组较SC组大鼠对新事物的探索能力明显提高,差异具有统计学意义:P<0.05,LV Lingo-1/sh RNA干预组vs.SC组、LV Lingo-1/sh RNA+HF干预组vs.SC组)。在空间探索能力上与新物体探索能力相似,但正常组与SC组差异更大(P<0.01),且联合干预效果更佳。P<0.01,SC组vs.正常组,LV Lingo-1/sh RNA干预组vs.SC组;P<0.05,SC组vs.阴性对照组,LV Lingo-1/sh RNA干预组vs.SC组。上述实验结果说明,LV Lingo-1/sh RNA干预可提高SC模型大鼠对新事物的探索能力。(2)HF干预组:通过新物体识别行为学实验,明确HF干预对SC模型大鼠新事物探索能力(用偏好指数表示)的影响。SC组大鼠对新事物的探索能力明显低于正常组和对照组,差异具有统计学意义:P<0.01,SC组vs.正常组;P<0.05,SC组vs.对照组,HF组vs.SC组。空间探索偏好指数上与新物体偏好指数相似,P<0.05,SC组vs.正常组,SC组vs.对照组,HF组vs.SC组。上述实验结果说明,单用HF也可提高SC模型大鼠对新事物的探索能力。(2)惊厥易感性:在SC后60天,再次采用注射氯化锂-皮罗卡品,诱导SC发作,比较不同组间的惊厥潜伏期(注射药物后到惊厥四级以上发作的时间),明确不同处理后,大鼠惊厥易感性变化。(1)LV Lingo-1/sh RNA干预组:与正常组和对照组相比,SC组大鼠的惊厥潜伏期明显缩短(SC组vs.正常组,SC组vs.对照组),差异具有统计学意义(P<0.01,SC组vs.正常组;P<0.05,SC组vs.对照组);LV Lingo-1/sh RNA片段干预后,SC大鼠的惊厥潜伏期明显长,差异具有统计学意义(P<0.01,SC组vs.LV Lingo-1/sh RNA干预组,P<0.001,SC组vs.LV Lingo-1/sh RNA+HF干预组)。提示LV Lingo-1/sh RNA可降低SC大鼠的惊厥易感性。(2)HF干预组:与正常组和对照组相比,SC组大鼠的惊厥潜伏期明显缩短(SC组vs.正常组,SC组vs.对照组),差异具有统计学意义(P<0.001,SC组vs.正常组,SC组vs.对照组);HF干预后,SC大鼠的惊厥潜伏期明显长,差异具有统计学意义(P<0.05,SC组vs.HF干预组)。提示HF可降低SC大鼠的惊厥易感性。(3)SD大鼠海马内MBP蛋白表达的变化:(1)LV Lingo-1/sh RNA干预组:经Western-blot检测发现SC组MBP蛋白显著低于正常组、对照组差异具有统计学意义(P<0.001,SC组vs.正常组,SC组vs.对照组);经LV Lingo-1/sh RNA片段干预后,MBP含量明显升高,SC组vs.LV Lingo-1/sh RNA干预组,SC组vs.LV Lingo-1/sh RNA+HF干预组,SC组vs.LV Lingo-1/sh RNA+HF干预组),差异具有统计学意义(P<0.001,SC组vs.LV Lingo-1/sh RNA干预组)。(2)HF干预组:经Western-blot检测发现SC组MBP蛋白显著低于正常组、对照组,差异具有统计学意义(P<0.001,SC组vs.正常组,SC组vs.对照组);HF干预后,其表达明显多于SC组差异具有统计学意义(P<0.001,SC组vs.HF组)。(4)脑组织病理变化:HE染色显示,SC后大鼠海马CA1、CA3区细胞核固缩深染,结构排列散乱,数量减少,神经元液化坏死;与SC组相比,经LV Lingo-1/sh RNA、LV Lingo-1/sh RNA+HF、HF干预后,海马结构重现,且细胞形态有所恢复,细胞数量较惊厥组有增多,但仍未能恢复到正常状态。进一步经尼氏染色观察尼氏小体的改变,结果与HE染色相似。即:SC后大鼠海马CA1、CA3区尼氏小体缺失明显,结构排列散乱,数量减少,与SC组相比,经LV Lingo-1/sh RNA、LV Lingo-1/sh RNA+HF、HF干预后,尼氏小体较惊厥组有明显增多,海马结构重现,尼氏小体数量较惊厥组有增多,但仍未能恢复到正常状态。结论:从行为认知实验中可以看出LV Lingo-1/sh RNA、HF能改善SC后的认知学习功能,延长惊厥的潜伏期。HF和Lingo-1沉默均能从病理上能对受损的海马结构和细胞有修复作用,减轻SC后的尼氏小体损伤,同时也能使髓鞘含量得以增加,提示HF和Lingo-1沉默对SC后损伤的海马结构、神经元、髓鞘有一定的修复作用。