青稞F7-OMT基因的克隆及表达分析

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青稞是青藏高原最有特色的作物,遗传类型丰富多样,具有“三高两低”(高纤维、高蛋白、高维生素和低糖、低脂肪)的结构组成和优良的医疗保健功能。其类黄酮和β-葡聚糖等营养物质丰富且显著高于普通大麦。其中类黄酮化合物与其生殖生长、生态防御、抗胁迫、抗病菌等密切相关。F7-OMT (Flavonoid 7-O-methyltransferase)能催化底物类黄酮苯环上的一个或多个羟基甲基化产生氧甲基类黄酮。使类黄酮具有更强的脂溶性,更有利于在细胞内的扩散,提高植物的抗逆性;还能通过提高人体中的口服利用率,从而产生更强抗病、抗癌、调节糖脂代谢、保护心脑血管及神经系统的作用。本研究以青稞“94-19-1”为材料,采用同源克隆和TA克隆的方法得到大量青稞F7-OMT基因片段,并进行生物信息学分析;通过亚克隆构建融合表达载体,对其诱导表达、优化表达条件,并采用亲和层析纯化法得到纯化蛋白;通过实时荧光定量PCR技术对F7-OMT在青稞和大麦高、低黄酮材料“94-19-1”、“肚里黄”、“扬农啤6号”和“红06-277”在UV和盐胁迫处理下表达状况进行了相对定量分析。旨在为进一步研究该酶蛋白功能和选育高抗性、高保健作用的青稞品种奠定基础。主要结果如下:1.通过同源克隆方法得到青稞F7-OMT基因并进行生物信息学分析表明:cDNA全长为1284 bp,其中包含开放阅读框1173 bp。碱基分布均匀,密码子偏爱性不强,有20个稀有密码子,GC含量不高,为53.03%。编码390个氨基酸,蛋白分子质量42207.8Da,分子式C1878H2977N497O562S22,等电点pI为5.36。在280 nm处摩尔消光系数为28420,半衰期为30 h,不稳定系数为40.69,属于不稳定蛋白。脂肪系数为96.49,总平均亲水性系数为0.127,属于疏水性蛋白。无信号肽序列,无跨膜结构,但含有丰富的糖基化、磷酸化位点和3个二硫键。具有Methyltransf2和Dimerization保守域,其His296为接受质子的活性位点,而Asp258为SAM结合位点。通过NCBI-blastp同源序列比对发现OMT家族蛋白序列保守性较低,但在青稞F7-OMT氨基酸序列中His296对应的组氨酸高度保守。系统发育树分析表明,该蛋白与单子叶植物OMT归为一类,与双子叶OMT在进化上有明显区分,但其保守性没有异黄酮O-甲基转移酶(IOMT)强,7-OMT家族并不是非常保守。2.通过亚克隆将F7-OMT基因连接到表达载体pET-32a上,构建pET-32a-F7-OMT1融合表达载体,在E.coli BL21(DE3)pLysS中经IPTG诱导表达,得到约60 kDa融合蛋白,同时通过时间及IPTG终浓度梯度优化表达。并按IPTG浓度0.8 mmol/L、5 h条件诱导其蛋白大量表达,从而采用亲和层析纯化法得到纯化蛋白。3.采用相对荧光定量分析方法,以大麦组成型表达基因β-actin作为内参,检测到经紫外线照射后,高黄酮含量青稞“94-19-1”和大麦“扬农啤6号”的叶中高水平表达,且前者显著高于后者,后者根中也有一定量的表达。经NaCl处理的材料叶、根中均发现表达水平极低。未经处理的“94-19-1”叶中表达量不高,但其他材料却表达量极低。
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