新生儿脓毒症(neonatal sepsis)是指细菌、病毒、真菌及原虫等入侵机体血液循环,产生毒素导致全身严重感染的临床综合征,是造成新生儿死亡的重要原因。特别是早产儿脓毒症,起病急,病死率高,如不及时发现或终止感染进程,可以迅速进展为脓毒症休克,极易引起终末器官衰竭和死亡。因此新生儿脓毒症的早期诊断与精准治疗对提高存活率、改善远期预后意义重大。有研究显示,新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit,NICU)住院患儿中,脓毒症休克的发病率为1.3%,其中早产、低出生体重儿病死率高,超低出生体重儿(extremely low birth weight,ELBW)病死率高达71%[1]。早产相关并发症是全球5岁以下儿童死亡的主要原因,脓毒症和其他严重感染所致的死亡约占总新生儿死亡的15%[2],而早产儿脓毒症休克的研究极少,因此急需进一步制定基于早产儿脓毒症研究的循证医学证据并不断更新诊治标准,以指导临床诊治及进行相关研究。由于早产儿多系统发育未成熟,血流动力学复杂且多变,因此非基于培养的临床诊断和脓毒症预测评分仍是判断新生儿脓毒症的积极研究领域。本课题第一部分针对114例脓毒症休克早产儿进行回顾性分析,研究脓毒症休克早产儿一般临床资料、围产期相关因素、实验室检查、病原学、并发症及影响预后高危因素,研究结果表明,羊水污染、凝血功能障碍、CRP水平升高与合并动脉导管未闭是脓毒症休克早产儿发生死亡的危险因素;血小板减少症和CRP持续升高对脓毒症休克早产儿预后有预测价值,研究结果为早产儿的救治以及更大规模的流行病学研究提供循证支持和重要的理论依据。基于前期的研究结果和文献报道,血小板减少症(neonatal thrombocytopenia,NT)是新生儿脓毒症常见的问题,并且是极低出生体重儿脓毒症相关死亡率最具预测性的独立危险因素。但NT与感染病原体的类型、临床显著的出血及预后之间相关性尚不清楚。本研究第二部分对已经证实培养阳性的663例脓毒症新生儿进行回顾性队列研究,旨在阐明脓毒症新生儿中NT的发生、严重程度、持续时间和血小板输注(Platelet transfusions,PT)与感染病原体类型的关系,并分析脓毒症死亡的危险因素。结果显示,脓毒症新生儿中NT的发生、严重程度与感染病原体类型有关,其中革兰氏阴性菌脓毒症新生儿NT的发生率高、持续时间长、病情重、接受PT比例及死亡率更高;早产、低出生体重、小于胎龄儿、革兰氏阴性菌和真菌感染与NT的发生有关;小于胎龄儿、革兰氏阴性菌感染、NT和PT是脓毒症新生儿死亡独立危险因素,其中发生NT患儿的死亡风险约是未发生的3倍,革兰氏阴性菌感染患儿的死亡风险约是阳性菌菌感染的2倍。这为脓毒症新生儿的救治提供新的思路,为临床血小板输注的必要性及减少不恰当用血提供理论依据。新生儿脓毒症临床症状多不典型,早期识别脓毒症对降低患儿病死率有重要作用。目前临床上仍然缺少判断脓毒症病程的特异性指标。近期研究报道脓毒症急性炎症期单核细胞的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD~+)比初始状态升高,而免疫抑制期的单核细胞再感染时其NAD~+水平的升高幅度低于正常单核细胞[3],这提示单核吞噬细胞能量状态的动态变化,特别是反映出的NAD~+水平与脓毒症病程进展关系密切。在此基础上,本研究使用能模拟脓毒症中单核巨噬细胞急性炎症状态和免疫抑制状态的人单核细胞系THP-1,检测LPS刺激下NAD~+主要代谢酶的表达变化情况,筛选出表达与脓毒症病程有潜在相关性的NAD~+代谢酶CD38,为脓毒症中关键代谢指标NAD~+的变化提供部分机制解释。同时在脓毒症新生儿外周血单核细胞中检测CD38的变化情况,探索发现CD38表达变化的临床意义,为CD38分子在脓毒症病程诊断中的进一步临床应用研究提供基础数据。第一部分脓毒症休克早产儿临床特点和预后分析研究目的:探讨脓毒症休克早产儿临床特点和预后危险因素。材料与方法:1、收集2014年02月至2017年01月我院NICU收治的114例脓毒症休克的早产患儿的临床资料进行回顾性分析。2、依据临床结局,分为治愈组和死亡组(包括治疗无效和放弃治疗出院后死亡者)。分析2组患儿的一般临床资料、围产期危险因素、临床特征及预后,以及相关并发症的发生情况。3、以t检验、Wilcoxon非参数检验、χ2检验或Fisher精确概率法对2组数据进行统计学分析。采用Logistic回归分析疾病预后的影响因素。采用受试者工作特性(receiver operating characteristic,ROC)曲线评价指标的预测价值。结果:1、114例患儿中治愈组87例,死亡组27例。死亡组羊水污染、贫血和血小板减少症(指血小板计数<100×109/L)的比例,以及C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平均高于治愈组[29.6%(8/27)与8.1%(7/87),2=6.618;22.2%(6/27)与5.9%(5/87),2=4.665;59.3%(16/27)与23.3%(20/87),2=12.546;36.0(1.0~80.0)与7.5(1.0~25.0)mg/L,Z=2.400];血红蛋白水平低于治愈组[(122.2±43.3)与(140.5±34.4)g/L,t=2.260](P值均<0.05)。2、死亡组动脉导管未闭、肺出血和凝血功能障碍患儿的比例高于治愈组[81.5%(22/27)与60.9%(53/87),2=3.871;37.0%(10/27)与12.6%(11/87),2=6.616;48.2%(13/27)与20.7%(18/87),2=7.847;P值均<0.05]。3、多因素Logistic回归分析发现:羊水污染、凝血功能障碍、动脉导管未闭和CRP水平是新生儿预后不良的危险因素(P值均<0.05)。4、114例患儿中共分离出77例病原体(治愈组66例,死亡组11例)。2组革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌的构成比分别为37.9%(25/66)与3/11,37.9%(25/66)与6/11,以及24.2%(16/66)与2/11。2组病原体类型分布差异无统计学意义。5、CRP的ROC曲线下面积为0.649(P=0.024)。当CRP为31 mg/L时,预测脓毒症休克早产儿不良结局的灵敏度和特异度分别是0.802和0.556,约登指数为0.358;血小板减少症的ROC曲线下面积为0.708(P<0.001),当血小板水平为94×109/L时,预测脓毒症休克早产儿不良结局的灵敏度和特异度分别是0.767和0.593,约登指数为0.360。结论:羊水污染、凝血功能障碍、CRP水平升高与合并动脉导管未闭是脓毒症休克早产儿发生死亡的危险因素。血小板减少症和CRP持续升高对脓毒症休克早产儿预后有预测价值。第二部分脓毒症新生儿血小板指数的变化及预后分析研究目的:探讨脓毒症新生儿中血小板减少症(neonatal thrombocytopenia,NT)的发生及严重程度、持续时间、血小板输注(Platelet transfusions,PT)与感染类型的关系及预后分析。材料与方法:1、采用回顾性队列设计,收集2015年01月至2017年12月入住我院NICU确诊脓毒症新生儿663例,所有病例经证实培养阳性,且病程中仅单一菌种类型感染。随访截止时间为入院后第28d,收集围产期相关因素、实验室检查、病原学类型及诊断信息、死亡情况及时间。2、根据胎龄分组描述患儿的围产期相关因素和血小板相关指标;采用单因素分析研究脓毒症患儿NT的发生与围产期相关因素的关系;采用单因素分析研究感染类型与围产期相关因素、血小板相关指标及预后的关系。3、采用Log-rank检验分析不同胎龄、NT严重程度、感染类型和PT对预后的影响。4、采用Cox回归研究28d生存情况和死亡的危险因素。结果:1、在663例脓毒症新生儿中,发生NT患儿345例(52.0%)。发生NT患儿中病原体类型:革兰氏阳性菌130例(37.7%)、革兰氏阴性菌169例(49.0%)、真菌46例(13.3%)。小于胎龄儿61例(19.9%);死亡55例(15.9%);差异有统计学意义(P<0.05)。2、极早产儿、早产儿和足月儿发生NT的比例分别82.9%(184/222),47.1%(65/138),30.1%(90/293);NT平均持续时间分别是7.0天(4.0-15.0)、4.0天(3.0-8.0)、5.0天(3.0-8.0);3组患儿在NT的发生率、PT和NT持续时间上差异有统计学意义(P<0.05)。3、脓毒症新生儿中接受PT的患儿有107例(16.4%);发生NT的患儿中,革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌脓毒症新生儿男性比例为71.6%(101/141例)与56.0%(93/166例);接受PT比例为:36.1%(51/141例)与12.7%(21/166例);机械通气时间:11.0天(5.0-25.0)与8.0天(4.0-14.0);新生儿窒息:27.7%与16.3%;病死率分别为:22.7%(32/141例)与9.0%(15/166例);组间差异有统计学意义(P<0.05)。4、与革兰氏阳性菌相比,革兰氏阴性菌感染脓毒症新生儿NT的发生率更高、初始值较低、持续时间更长、接受PT比例更高、病死率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。5、经过Cox回归分析,脓毒症新生儿28d死亡的独立危险因素有:小于胎龄儿(HR=1.97)、革兰氏阴性菌感染(HR=2.00)、NT(HR=2.86)和PT(HR=1.95)。结论:1、早产、低出生体重、小于胎龄儿、革兰氏阴性菌和真菌感染与NT的发生有关。2、脓毒症新生儿中NT的发生、严重程度与不同感染类型有关;其中革兰氏阴性菌脓毒症新生儿男性比例、NT发生率、持续时间、医疗负担、接受PT比例及死亡率更高。3、小于胎龄儿、革兰氏阴性菌感染、NT和PT,是脓毒症新生儿死亡独立危险因素,其中发生NT患儿的死亡风险约是未发生的3倍,革兰氏阴性菌感染患儿的死亡风险约是阳性菌菌感染的2倍。第三部分NAD~+代谢酶CD38在新生儿脓毒症中表达变化的基础和临床研究研究目的:1、在人单核细胞系THP-1中检测LPS刺激下NAD~+主要代谢酶的表达变化情况,筛选并验证表达与脓毒症病程有潜在相关性的NAD~+代谢酶,为脓毒症中关键代谢指标NAD~+的变化提供部分机制解释。2、在脓毒症新生儿外周血中检测NAD~+消化酶CD38的变化情况,探索发现新生儿脓毒症中外周血单核细胞CD38表达变化的临床意义,为脓毒症病程诊断提供潜在指标。材料与方法:1、根据文献报道和生物信息学数据库提示,列出相关待检测的NAD~+代谢酶家族成员,设计并合成对应的定量PCR引物(参考primerbank网站设计)。2、使用LPS刺激人单核细胞系THP-1,刺激后收集细胞提取RNA,反转录成c DNA,以其为模板使用定量PCR检测炎症因子以及NAD~+代谢酶的变化。3、通过t-检验筛选出LPS刺激后表达与刺激前的初始值存在统计学差异的代谢酶分子CD38。对THP-1细胞LPS刺激模型提取蛋白后,使用Western Blot检测CD38蛋白表达水平的变化。4、进一步在THP-1细胞内毒素耐受模型中,使用定量PCR与Western Blot检测CD38 m RNA与蛋白的变化情况。5、在临床收集对照组新生儿与脓毒症组新生儿外周血样品并提取RNA,逆转录获得c DNA,同时记录病历。使用定量PCR检测CD38 m RNA的表达。6、进一步使用流式细胞术检测脓毒症组新生儿与对照组新生儿外周血白细胞中CD38的分布情况以及表达差异。分析CD38变化对新生儿脓毒症病程判断的作用及临床意义。结果:1、LPS刺激下THP-1细胞的定量PCR结果显示,三类NAD~+消化酶中,LPS刺激24小时以后只有CD38与Sirtuin6的m RNA水平出现了明显升高,且CD38 m RNA水平升高最为明显,而其他NAD~+消化酶m RNA水平没有出现明显升高。2、LPS刺激下THP-1细胞的Western Blot检测结果显示CD38的蛋白水平出现明显升高。3、内毒素耐受阶段THP-1细胞在LPS再次刺激下CD38蛋白量仍能再次升高,且在LPS再次刺激下,内毒素耐受THP-1细胞中CD38的m RNA与蛋白水平均高于同时间点的正常THP-1细胞。4、定量PCR与流式细胞术结果显示,与正常对照组新生儿相比,脓毒症新生儿血样中白细胞CD38 m RNA和CD38+细胞比例均显著升高。5、对照组新生儿与脓毒症组新生儿外周血白细胞中CD38阳性细胞主要分布在单核细胞中,脓毒症新生儿单核细胞中CD38的阳性率比对照组新生儿明显升高且有显著差异。结论:正常THP-1细胞在LPS刺激下NAD~+消化酶CD38的m RNA与蛋白水平升高,内毒素耐受期THP-1细胞在LPS刺激下CD38表达能进一步升高。可以部分解释此前文献报道的现象:免疫抑制期间的单核细胞再感染时,其NAD~+水平的升高幅度低于正常单核细胞。定量PCR与流式细胞仪检测临床血样发现脓毒症新生儿外周血白细胞中CD38表达比对照组新生儿明显升高。脓毒症新生儿单核细胞中CD38的阳性率比对照组新生儿明显升高。提示单核细胞表面CD38的表达升高可能作为脓毒症诊断与病程判断的一个潜在指标。充分阐明以NAD~+代谢酶CD38为代表的代谢相关酶类的表达在脓毒症病理过程中的变化与作用,可以为脓毒症病程诊断提供新的理论依据。