【摘 要】
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甘油单酯脂肪酶（MGL）是一种具有特异底物选择性的脂肪酶,可专一地水解甘油酯底物。MGL是生物体内功能调节的关键酶,参与神经信号传导、癌症的发生及抗炎响应等。开展MGL结构功能关系的研究可为深入理解其生理功能提供基础。同时微生物来源的MGL具有工业应用前景,在食品油脂改性、药物合成、生物化工等领域具有广阔的应用价值。不断进行新型MGL的发掘、结构功能及理性改造研究,以满足工业应用的需求。本课题以来
【基金项目】
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国家十三五重点研发计划项目（2018YFC0311104）; 国家杰出青年科学基金项目（31725022）
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甘油单酯脂肪酶（MGL）是一种具有特异底物选择性的脂肪酶,可专一地水解甘油酯底物。MGL是生物体内功能调节的关键酶,参与神经信号传导、癌症的发生及抗炎响应等。开展MGL结构功能关系的研究可为深入理解其生理功能提供基础。同时微生物来源的MGL具有工业应用前景,在食品油脂改性、药物合成、生物化工等领域具有广阔的应用价值。不断进行新型MGL的发掘、结构功能及理性改造研究,以满足工业应用的需求。本课题以来源于海洋微生物Cytobacillus oceanisediminis的甘油单酯脂肪酶CoMGL为研究对象,通过异源重组表达、酶学性质表征、晶体结构解析及嵌合体构建和晶体比对分析研究并阐述了调控其催化表现的分子结构基础。主要研究内容如下:（1）CoMGL的制备与酶学性质表征。通过全基因合成技术获得了海洋芽孢杆菌来源的comgl基因,将其克隆至p ET-30a（+）载体中,并实现了其在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效异源表达。通过镍柱亲和层析进行纯化,每升发酵液可得到172.6 mg纯化目的蛋白。对纯化后的CoMGL进行酶学性质表征,结果显示:其最适反应温度为50℃,最适反应p H为9.0,在p H 10.0条件下孵育12小时酶活力依然保持有60%以上。CoMGL只特异性地水解甘油单酯,而不能水解甘油二酯和甘油三酯,因此将其归类为甘油单酯脂肪酶家族。（2）CoMGL晶体制备与结构解析。使用凝胶色谱层析对CoMGL进一步纯化得到了满足结晶条件的纯蛋白,通过初筛和优化,得到了最适结晶条件:18℃静置生长5天,结晶试剂为:0.2 M四水乙酸镁,0.1 M二甲胂酸钠p H 6.8,19%（w/v）PEG 8000。通过分子置换解出了分辨率为1.25?的CoMGL晶体结构（PDB ID:7E04）。CoMGL属于典型的α/β水解酶结构,“盖子”结构区域为Asn120-Val171,催化三联体是Ser97、Asp194和His224,氧负离子洞由Phe29和Met98位氨基酸主链上的-NH-构成。（3）脂肪酶CoMGL嵌合体的构建与热稳定性分析。构建了5个CoMGL和海洋土芽孢杆菌GMGL的N端替换的酶嵌合体,通过热稳定性及酶活力比较分析发现,嵌合体GMGL-160-CoMGL的最适反应温度相较于CoMGL提高了20℃,最适条件下比酶活提高了3.9倍。进一步对GMGL-160-CoMGL嵌合体进行了晶体制备及结构解析（PDB ID:7E0N）。通过序列和结构比对分析发现了α5区域是造成嵌合体性能提高的关键区域,其中Asn149、Asp151及Ile152等氨基酸对酶热稳定性调控可能起到关键的作用。
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