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随着大剂量免疫抑制剂、化疗药物以及广谱抗生素的应用,侵袭性真菌感染(invasive fungal infections,IFI)的发病率及死亡率在全球范围内迅速上升。由于缺乏临床特征,血液真菌分离培养敏感性很低,IFI的病原学诊断十分困难,特别是侵袭性烟曲霉感染。因此,迫切需要研究发展敏感性强、特异性高的非培养诊断方法来改善侵袭性真菌感染的病原学诊断。目的通过烟曲霉深部感染动物模型的建立,考察巢式PCR方法及血清半乳甘露聚糖(GM)测定方法在侵袭性烟曲霉感染早期诊断中的价值;并对烟曲霉深部感染过程中所释放的优势抗原成分进行初步探讨。方法选择几种常见真菌,分别用六种方法(液氮冻融、-70℃冻融、溶胞酶消解、超声破碎、高盐溶液、尿素溶液)裂解真菌细胞壁,再用市售DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒提取DNA,通过对提取物进行比色定量和PCR检测评价各种提取方法的优弊;建立烟曲霉深部感染动物模型,收集不同感染时期动物血液标本进行巢式PCR的检测,并与血培养及影像学检查结果比较分析;评价巢式PCR在临床烟曲霉感染高危病人标本检测中的应用价值,并与血清半乳甘露聚糖水平测定比较分析;提取烟曲霉全菌蛋白和分泌蛋白,用侵袭性烟曲霉感染动物不同感染阶段的血清进行免疫印迹,筛选烟曲霉早期免疫反应性抗原。结果(1)酶消解破壁法提取真菌DNA效率最高,重复性良好。模拟全血标本中白假丝酵母菌检测限为10~2个孢子,烟曲霉及新型隐球菌检测限为10~3个孢子。(2)巢式PCR在烟曲霉深部感染家兔发病早期(第2天)出现阳性结果,并可持续数日,优于培养及影像学检查方法;巢式PCR和GM检测在临床诊断为IA患者的标本评价中显示,其敏感性分别为69%和62%,特异度分别为100%和95%。(3)烟曲霉分泌型蛋白成分可刺激疾病模型动物产生抗体,在病原学诊断中具有较高的应用价值。其中免疫反应性较强的蛋白分子量大小为10 kDa-30 kDa。结论在六种真菌基因组DNA提取方法中,酶裂解结合试剂盒提取方法最为简便有效;巢式PCR在早期诊断侵袭性烟曲霉感染中具有较好的应用价值;通过动物疾病模型,初步筛选到能刺激机体早期产生免疫反应的优势抗原成分,为10-30 kDa的分泌型蛋白,该类蛋白及其抗体可望作为免疫学诊断方法的检测指标。