深静脉血栓形成(Deep vein thrombosis,DVT)是较为常见的外周血管系统疾病之一,深静脉血栓的发生多是由于血管内皮损伤、血流动力学改变及血液异常高凝状态等原因所导致。其中急性期下肢血栓如发生脱落,则有引起肺动脉栓塞(pulmonary embolism,PE)的风险,死亡率较高,严重威胁患者的生命健康。如短期内血栓无法全部清除则发生血栓机化,远期发展为血栓形成后综合征(post-thrombotic syndrome,PTS),其表现为下肢疼痛肿胀、皮肤色素沉着、感觉异常、下肢皮肤反复溃疡等临床表现,严重影响患者生活质量。目前临床上常用的治疗方法包括单纯抗凝治疗、手术取栓、微创介入治疗等。虽然这些治疗手段对于急性期的血栓有着较好的疗效,但对于慢性期血栓以及血栓机化后造成的内皮损伤治疗效果有限。干细胞是目前缺血性疾病的研究热点之一,其中内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)作为内皮细胞的前体细胞,具有定向分化为成熟内皮细胞的潜在能力,在新生血管形成以及受损内皮修复的过程中发挥重要作用。已有的研究已经证明在深静脉血栓发生之后内皮祖细胞可以定向迁移至血栓部位,参与到血栓中血管新生,但由于内皮祖细胞在正常人体循环中含量较少且内皮祖细胞本身增殖能力较弱等一些特点,目前内皮祖细胞在临床上的应用仍然受到一定的限制。因此,如何提高内皮祖细胞在循环中的含量,增强内皮祖细胞的生物学功能,从而提高内皮祖细胞在体内发挥作用是目前的研究热点。此外,内皮祖细胞根据出现时间、细胞形态、表面标志物等不同可分为早期内皮祖细胞(Early endothelial progenitor cells,eEPCs)和晚期内皮祖细胞(Late endothelial progenitor cells,lEPCs),这两种细胞为内皮祖细胞的不同分化时期所产生,两者在增殖、成血管、旁分泌能力上均有不同。因此早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞在对血栓溶解再通过程中所发挥的作用也不一样,但目前对于两者在这一过程中的具体功能还不十分清楚。非编码核糖核苷酸(non-coding RNA,ncRNA)是指各种不翻译成蛋白质的RNA分子。这些RNA都可以从基因组转录而来,但不进行翻译过程,可在RNA水平行使各自的功能。非编码RNA主要包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA以及microRNA等。其中微小RNA(microRNA,miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为20-24个核苷酸的小RNA,其在细胞内具有多种重要的调节作用。目前的研究表明哺乳动物中大约30%的基因受到miRNA的调控。miRNA在细胞分化,生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。我们前期的研究也发现了一些miRNA可以参与内皮祖细胞的生物学功能调节,因此本实验中我们重点探究了 miRNA-150对内皮祖细胞分化过程的影响以及对生物学功能的调节作用,并对内皮祖细胞移植后对血栓的机化再通作用进行了进一步的探讨。本研究丰富了内皮祖细胞功能调节以及移植治疗血栓作用的理论基础,并为深静脉血栓及其他缺血性疾病的细胞治疗研究提供了重要的理论依据。本次研究主要分为以下五个部分:第一部分 人外周血来源早期及晚期内皮祖细胞的培养及鉴定目的:验证成人外周血来源早期及晚期内皮祖细胞的分离、培养和鉴定方法,为后续体内及体外实验提供纯度较高的实验工具细胞。方法:抽取健康成年人外周血60 ml,采用密度梯度离心法分离获得成人外周血来源的单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs),再利用差速贴壁法定向诱导培养出内皮祖细胞,通过细胞形态学特征、细胞表面标志物以及Dil-Ac-LDL与FITC-UEA-1双荧光染色验证所获得细胞为内皮祖细胞。结果:通过密度梯度离心法获得单个核细胞继续培养1天后可见少量细胞贴壁,呈现出椭圆形、圆形,大小不一;贴壁细胞继续培养5-7天以后,镜下可见细胞集落形成,集落中间细胞呈圆形,周围细胞呈现长梭形或不规则形;细胞培养至14-21天后,可见细胞铺满培养板,细胞集落消失,细胞呈典型鹅卵石样外观。Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1双荧光染色显示细胞可吞噬Dil-ac-LDL并结合FITC-UEA-1。流式细胞学检测细胞表面标志物发现培养细胞可表达CD34、VEGFR2、CD133、CD31、CD45、CD14、vWF等。结论:密度梯度离心法结合差速贴壁法可以得到人外周血来源的内皮祖细胞,所获细胞符合EPCs特点的形态学特点,Dil-Ac-LDL与FITC-UEA-1双荧光染色以及流式细胞学检测进一步证实所获细胞纯度较高,能够满足后续实验要求。第二部分 miR-150对内皮祖细胞分化及生物学功能的影响目的:探讨miR-150对内皮祖细胞的分化及生物学功能的影响。方法:1.分别收集不同培养阶段的内皮祖细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应监测早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞中miR-150的表达水平。2.分别调控早期内皮祖细胞以及晚期内皮祖细胞中miR-150的表达含量,使用lipofectamine 3000将miR-150 模拟物(miR-150 agomir)以及 miR-150 抑制物(miR-150 antagomir)转染入细胞中,再次检测早期内皮祖细胞及晚期内皮祖细胞中miR-150的表达水平。3.使用体外及体内成血管实验、增殖实验等检测表达调控后的内皮祖细胞的增殖、迁移以及成血管能力。结果:l.miR-150在早期内皮祖细胞以及晚期内皮祖细胞中表达水平不同,与早期内皮祖细胞相比,晚期内皮祖细胞中miR-150表达水平显著提高;2.体外及体内成血管实验显示早期内皮祖细胞高表达miR-150后,其成血管能力显著提高,而晚期内皮祖细胞中抑制miR-150表达,其成血管能力有所下降;3.增殖实验也显示出相较于早期内皮祖细胞未处理组,当细胞中miR-150表达水平升高时,其增殖能力提升,而晚期内皮祖细胞中miR-150表达水平降低后,其增殖能力受到抑制;4.旁分泌实验检测IL-8以及VEGF,结果显示早期内皮祖细胞中增加miR-150表达水平后,其IL-8以及VEGF分泌能力下降,晚期内皮祖细胞中抑制miR-150表达水平后,其表达水平未有上升。结论:l.miR-150在内皮祖细胞分化不同阶段中表达水平不同;2.miR-150在内皮祖细胞中表达水平升高可促进其成血管能力提升;3.miR-150在内皮祖细胞中表达水平提高与其增殖能力提升有关;4.miR-150在内皮祖细胞中水平升高可抑制早期内皮祖细胞分泌VEGF以及IL-8。第三部分 miR-150调控内皮祖细胞分化的机制研究目的:研究miR-150调控内皮祖细胞分化的具体作用机制。方法:1.分别调控早期内皮祖细胞以及晚期内皮祖细胞中miR-150的表达含量,使用 lipofectamine 3000 将 miR-150 模拟物(miR-150 agomir)以及 miR-150 抑制物(miR-150 antagomir)转染入细胞中,提取不同组细胞中总蛋白,采用western blot检测不同组细胞中 pSer473 Akt、total Akt、pSer256 FOXO1 以及 total FOXO1 的蛋白含量;2.将早期内皮祖细胞与Akt信号通路阻断剂wortmannin共培养后采用流式细胞学检测内皮祖细胞表面标志物变化;3.采用体外成血管实验检测早期内皮祖细胞与wortmannin共培养后成血管能力改变;4.采用增殖实验检测早期内皮祖细胞与wortmannin共培养后增殖能力改变;5.ELISA实验检测早期内皮祖细胞与wortmannin共培养后旁分泌能力改变情况。结果:1.Western blot结果显示晚期内皮祖细胞中Akt表达水平高于早期内皮祖细胞,提高早期内皮祖细胞中miR-150的表达水平后,pSer473 Akt表达水平升高,加入Akt通路抑制剂wortmannin后Akt磷酸化水平受到抑制,此外,晚期内皮祖细胞中FOXO1表达水平高于早期内皮祖细胞,提高早期内皮祖细胞中miR-150表达后FOXO1磷酸化水平升高,反之,抑制Akt通路后,FOXOl磷酸化水平降低;2.细胞流式学检测发现早期内皮祖细胞中加入wortmannin后其表面标志物发生改变;3.体外成血管实验发现阻断Akt通路后可降低内皮祖细胞的成血管能力;4.增殖实验结果提示加入wortmannin后可抵消miR-150对于早期内皮祖细胞的促增殖作用;5.旁分泌实验结果显示加入wortmannin后可抵消miR-150对于早期内皮祖细胞旁分泌能力的抑制作用。结论:I.Akt/FOXO1信号通路参与调控内皮祖细胞的分化过程;2.阻断Akt/FOXOl信号通路后可抑制miR-150对于早期内皮祖细胞的生物学调节功能。第四部分 miR-150靶基因预测和验证目的:预测及验证miR-150在调控内皮祖细胞分化中可能的靶基因。方法:1.利用生物信息学预测miR-150可能的靶基因;2.western blot检测早期以及晚期内皮祖细胞中靶基因的蛋白表达水平;3.荧光素酶报告基因实验、qPCR以及western blot验证miR-150靶基因;4.western blot检测内皮祖细胞中miR-150靶基因受到抑制后对于Akt/FOXO1信号通路的影响。结果:1.生物信息学预测c-Myb为miR-150可能的靶基因;2.western blot结果显示早期内皮祖细胞中c-Myb表达水平高于晚期内皮祖细胞;3.荧光素酶报告基因实验显示miR-150可与含有c-Myb 3’UTR区质粒结合降低荧光强度,qPCR以及western blot检测发现miR-150升高可降低c-Myb的表达水平;4.western blot结果进一步发现c-Myb可以参与调控内皮祖细胞中Akt/FOXOl信号通路。结论:1.c-Myb为miR-150的靶基因;2.c-Myb参与调控内皮祖细胞中Akt/FOXOl信号通路。第五部分 早期内皮祖细胞及晚期内皮祖细胞对静脉血栓溶解再通的影响目的:研究不同分化阶段内皮祖细胞对静脉血栓溶解再通的影响。方法:1.建立裸大鼠深静脉血栓模型,将所建立模型分为五组:A组(10只),空白对照组,经尾静脉注入lml PBS;B组(10只),eEPCs组,经尾静脉注入lml含有l×106早期内皮祖细胞的细胞悬液;C组(10只),eEPCs/miR-150+lEPCs组,经尾静脉注入lml混合有l×106晚期内皮祖细胞以及上调miR-150表达的早期内皮祖细胞的细胞悬液;D组(10只),eEPCs/NC+lEPCs组,经尾静脉注入lml混合有1×106晚期内皮祖细胞以及早期内皮祖细胞的细胞悬液;E组(10只),lEPCs组,经尾静脉注入1ml晚期内皮祖细胞的细胞悬液。2.术后7天收集血栓标本,通过HE染色检测炎症细胞聚集以及新生血管情况;血栓称重检测各组中血栓重量;免疫组化染色检测微血管形成情况;数字减影血管造影观察静脉血栓溶解再通情况。结果:1.HE染色比较各实验组中炎症细胞聚集以及血栓溶解再通情况,结果显示eEPCs/miR-150+lEPCs组中新生血管含量最多,溶解再通情况最好;2.称量各组中血栓标本,结果显示相对于空白对照组,各个细胞移植组中血栓重量均有不同程度减少,其中eEPCs/miR-150+lEPCs组中血栓重量最轻;3.免疫组化染色结果显示eEPCs/miR-150+lEPCs组中,CD34阳性管壁最多;4.数字减影血管造影比较各实验组下腔静脉造影剂,结果显示相较于空白对照组,各个细胞移植组中均有血流恢复再通,其中eEPCs/miR-150+lEPCs组血流恢复情况最好。结论:1.各个分化阶段的内皮祖细胞均可以促进静脉血栓的溶解再通;2.混合移植上调miR-150的早期内皮祖细胞以及晚期内皮祖细胞促进血栓溶解再通的效果最好。