利用储量丰富且可再生的食品和农业废弃物生产生物基能源和化学品具有重要的经济、环保价值。现有生产工艺中的主要瓶颈是缺乏高效的木质纤维素降解酶和高效、经济的产品生产工艺。木质纤维素降解酶主要包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木质素降解酶,其中果胶酶,长期以来被认为是一类不重要的辅酶,被严重低估。此外,纤维二糖酸,是一种高附加值但目前产能较低的有机酸,具有重要经济价值。因此,为了发掘高效、新颖木质纤维素降解酶及降低纤维二糖酸生产工艺成本,本研究主要通过构建具有高效木质纤维素降解能力的堆肥生境并进行宏基因组学分析,挖掘新颖木质纤维素降解酶并研究其在纤维二糖酸生产中的作用,并进一步探索统合生物加工生产纤维二糖酸中预处理工艺。论文的主要研究内容和结果如下:1.高效木质纤维素降解堆肥生境的构建及宏基因组学分析通过定向富集培养技术,构建了具有高效木质纤维素降解能力的堆肥体系(apple pomace-adapted compost microbial community,APACMC)。在富集培养过程中,堆肥体系的最高温度达68℃,呈现出堆肥典型的升温期、高温期、降温期和腐熟期四个阶段;16S r DNA高通量测序发现微生物群落结构发生了剧烈变化,具有木质纤维素降解能力的微生物群落得到了良好的富集。随后借助宏基因组学技术对该微生物群落进行高通量鸟枪测序,获得了272,516条开放阅读框;借助多种生物信息分析软件和数据库进行分类学和功能注释发现,APACMC主要由来自变形菌门、拟杆菌门、放线菌门的微生物组成;最主要的功能类型是氨基酸代谢和碳水化合物代谢。基于CAZy数据库注释发现APACMC中具有很高丰度、多样性且微生物来源广泛的碳水化合物活性酶。2.纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的宏基因组学挖掘通过刚果红染色试验和酶活测定发现APACMC具有较高的木质纤维素降解能力。APACMC中木质纤维素降解酶主要来源于变形菌门、放线菌门和拟杆菌门;功能和代谢注释分析揭示了APACMC中蕴含大量的参与碳水化合物代谢和潜在生物能源物质的合成路径。基于碳水化合物活性酶数据库挖掘到3,882条序列编码纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的基因序列;另外,基于漆酶和多铜氧化酶数据库发现了额外94条编码漆酶和多糖氧化酶的序列。同时,根据催化结构域分析发现了有大量的细菌来源的多功能酶、嗜热酶和裂解性多糖单加氧酶等具有工业应用潜能的酶。3.宏基因组学挖掘果胶降解微生物、果胶酶及嗜热果胶酶的分离、纯化及表征钌红染色和果胶降解率试验表明APACMC具有较高的果胶降解能力。COG功能注释发现APACMC中参与果胶降解的功能占总碳水化合物降解的25.8%。总计1,756条序列被注释为果胶降解酶,且大部分序列具有较高的新颖性,追溯其系统起源发现,这些序列主要来自APACMC中丰度很高的微生物。此外,从APACMC中分离得到了36株嗜热果胶降解微生物,其中Bacillus subtilis Z10具有最高的果胶酶活性;通过简并引物以及融合引物与巢式聚合酶链式反应扩增获得了一条1,263 bp编码果胶裂解酶的序列;基于生物信息学对该酶的理论等电点和理论分子量的预测,结合色谱纯化获得了果胶裂解酶Bs Pel-Z10;酶学特性表明该酶属于嗜热果胶裂解酶且具有很好的稳定性。4.宏基因组来源的新颖木质纤维素降解酶的异源表达及分析从APACMC宏基因组中筛选具有完整开放阅读框且与数据库中收录蛋白的相似度低于75%的5条来自AA10、CE15、GH43、漆酶和PL11的序列为研究对象,经过去除信号肽等一系列分析及处理后,进行基因合成。随后将编码AA10的序列无缝克隆至p ET-22b(+)表达载体上的pel B序列后;其余序列通过双酶切克隆至p ET-28a(+)载体上。将构建成功的重组质粒转导至E.coli BL 21中,获得重组工程菌,并诱导重组酶的表达。这五个重组酶都成功地实现了表达及纯化,并且都具有相应的酶活。生物信息学分析序列信息、系统发育和结构特性等表明这些酶具有较高的新颖性。5.漆酶、纤维二糖脱氢酶(CDH)和木质素在纤维二糖酸生产中的协同作用研究发现当以Avicel为底物时,添加外源氧化还原介体ABTS是实现纤维二糖酸高产的必要条件,而以小麦秸秆为发酵底物时ABTS无促进作用。向Neurospora crassa HL10发酵体系和CDH-漆酶无细胞体系中添加小麦秸秆来源的天然木质素后,发现木质素在漆酶的帮助下可以促进CDH将纤维二糖转化为纤维二糖酸。在N.crassa HL10发酵体系中添加适量的木质素可以促进纤维二糖酸的生产,而过量的木质素则造成负面作用。此外,木质素不会影响CDH和漆酶酶活。通过电子顺磁共振光谱仪发现漆酶催化木质素产生的自由基可以被CDH氧化纤维二糖产生的还原性CDH消耗,证实了木质素可以作为CDH-漆酶的氧化还原介体促进纤维二糖酸的生产。此外,停流光谱仪表明CDH和漆酶之间存在电子传递。6.工程菌N.crassa HL10直接从预处理小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸比较了碱、稀硫酸和湿热这三种预处理的小麦秸秆作为发酵底物被N.crassa HL10统合生物加工生产纤维二糖酸的产量,结果表明碱预处理的小麦秸秆(AP-WS)具有最高的纤维二糖酸产量(45.722 m M)。此外,从这三种预处理样品中提取了残留的木质素,发现从AP-WS中提取的木质素(AP-WS-L)在N.crassa HL10以Avicel为底物的体内发酵体系和CDH-漆酶无细胞体系中都具有最好的氧化还原介导能力。FTIR、XRD和GPC结果表明这三种预处理小麦秸秆及其相应木质素在结构、纤维素结晶度、分子量等方面的差异是造成不同纤维二糖酸产量的深层原因。