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目的：甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)的促成骨作用是其治疗骨质疏松症的重要药理基础,然而对其促进成骨细胞分化的细胞基础和影响因素等尚存争议,其作用机制也未完全阐明。PTH有调节成纤维生长因子(fibroblast growth factor, FGF)23表达的作用,而FGF23对成骨细胞分化和基质矿化具有直接影响。细胞FGF23表达是否影响PTH的促成骨细胞分化作用等尚不明确。为此,本文利用体外培养大鼠成骨细胞,在观察rhPTH1-34促成骨细胞分化的基础上,采用RNA干扰技术沉默其FGF23的表达,研究内源性FGF23对PTH促分化作用的影响。方法：1.采用酶消化法分离培养新生SD大鼠头盖骨成骨细胞,应用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色和体外矿化结节茜素红(Alizarin Red staining, ARS)染色进行成骨细胞功能学鉴定。2.为观察PTH对成骨细胞分化的作用,本文以重组人甲状旁腺激素(recombinant human parathyroid hormone, rhPTH)1-34间隙循环加入作用3d,应用PNPP法和MTT法检测体外培养大鼠成骨细胞总碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞增殖率,分别以OD405nm/孔和OD570nm/L表示,并以OD405nm/OD570nm计算细胞ALP比活性。为进一步观察rhPTH1-34对成骨细胞分化的时效作用,以10-9mol/L rhPTH1-34一次性给予后,分别于2h、8h和24h连续取样,应用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)技术分析成骨细胞ALP和骨钙素(OCN) mRNA水平变化。3.为明确PTH对成骨细胞FGF23表达的作用,本文采用10"9mol/L rhPTH1-34一次性给予后,分别于2h、8h和24h连续取样,应用Real-time PCR技术观察细胞FGF23转录水平变化。进一步以10"9mol/L rhPTH1-34作用3d后,收获细胞应用Western blot技术检测胞内FGF23蛋白水平。4.为研究内源性FGF23在PTH促成骨细胞分化中的作用,本文采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,以大鼠成骨细胞FGF23mRNA213～235位点为靶序列设计小发夹RNA (FGF23i-shRNA),以慢病毒载体pLKO.1为骨架,构建重组载体。采用脂质体法转染沉默大鼠成骨细胞FGF23表达后,以10-9mol/L rhPIH1-34作用2h,取细胞应用Real-time PCR分析其FGF23.ALP和OCN mRNA水平。结果：1.PTH对体外培养成骨细胞分化具有一定刺激作用。PNPP法检测结果显示,10-12～10-8mol/L rhPTH1-34间隙循～环作用3d细胞总ALP活性增加14.8%-40%(P<0.05P<0.001),以10-9mol/L浓度作用最明显。MTT法测定结果显示,10-10～10-8mol/L rhPTH1-34间隙循环作用3d细胞增殖率增加31.6%-50.5%(P<0.05～P<0.001)。细胞ALP比活性(OD405nm/OD570nm)在2.1-2.4之间波动,与对照组比较差异无统计学意义。Real-time PCR结果显示,10"9mol/L rhPTH1-34作用2h时细胞ALP mRNA水平增加35%(P<0.05),8h和24h时逐渐恢复;OCN mRNA水平在2h时有增加趋势(16%,P>0.05),8h时增加幅度加大至80%(P<0.05),24h时恢复。2.PTH上调体外培养成骨细胞FGF23表达。Real-time PCR结果显示,10-9mol/L rhPTH1-34作用2h时细胞FGF23mRNA水平增加4倍(P<0.001),8h时增加67%(P<0.05),24h时恢复。Western blot分析结果显示,10"9mol/L rhPTH1-34作用3d细胞FGF23蛋白表达有增加趋势(41%),但差异无统计学意义(P>0.05)。3.FGF23基因沉默后PTH促成骨细胞分化作用明显增强。Real-time PCR结果显示,10-9mol/L rhPTH1-34作用2h,FGF23沉默(FGF23i-shRNA)细胞FGF23表达无上调,而其ALP和OCN表达明显上调,其转录水平分别增加1.8倍(P<0.05)和5.8倍(P<0.01),明显高于空载体转染细胞的43.5%(P<0.05)和25.5%(P>0.05)。结论：1.PTH对体外培养成骨细胞分化具有一定刺激作用；2.PTH上调体外培养成骨细胞FGF23表达;3.FGF23基因沉默后PTH促分化作用明显增强。