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研究背景和目的:结直肠癌在全世界范围内的发病率居高不下,在我国,结直肠癌的发病率和死亡率也在不断的上升,每年有大量的患者死于结直肠癌。因此,新的治疗手段及药物的出现迫在眉睫。KRAS作为RAS基因家族重要的一员,在结直肠癌的发病和疾病进展中发挥着重要的作用,但其作用机制尚不十分清楚,有待进一步的探索。MicroRNA(miRNA)可通过负调控靶基因表达参与肿瘤的发生发展过程。本课题旨在研究KRAS表达异常在结直肠癌发病中的调控机制,筛选出影响KRAS表达的上游miRNA,并探索miRNA-KRAS信号通路对结直肠癌增殖、侵袭、凋亡以及体内成瘤等生物学行为的影响,从而为结直肠癌治疗提供新的依据和思路,有望研制出针对此通路的药物来抑制肿瘤的生长。研究方法:临床水平实验:首先我们收集来自天津医科大学肿瘤医院经手术切除的患者的结直肠癌组织及其对应的癌旁正常组织,分别采用Western blot及qRT-PCR方法检测KRAS蛋白及其mRNA表达水平;然后我们采用三种生物信息学软件筛选出miR-16可能靶向调控KRAS基因的表达;最后采用qRT-PCR中的Taqman探针法检测组织中miR-16的表达水平。细胞水平实验:虽然通过生物信息学软件预测了miR-16可能靶向调控KRAS,但还需进一步验证,此时我们采用了荧光素酶报告(Luciferase)实验来验证miR-16是否能直接调控KRAS的表达;分别向SW480和HT-29细胞中转染miR-16类似物(pre-mi R-16),Caco2细胞中转染miR-16抑制剂(anti-mi R-16),48h后收集细胞,提蛋白和RNA后检测miR-16的表达水平及KRAS蛋白和KRAS mRNA表达水平;分别采用miR-16类似物和mi R-16抑制剂上调或下调miR-16的表达水平,然后分别利用CCK8增殖实验、Transwell实验及细胞凋亡实验验证miR-16对结直肠癌细胞生物学行为的影响;分别利用针对KRAS的siRNA和过表达质粒下调或上调结直肠癌细胞中KRAS的表达,验证KRAS对结直肠癌细胞生物学行为的影响;最后在SW480细胞中同时转染miR-16类似物和过表达KRAS的质粒,验证mi R-16-KRAS信号通路对结直肠癌细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学行为的影响。动物水平实验:将未经处理的SW480细胞、过表达mi R-16的SW480细胞、过表达KRAS的SW480细胞以及同时过表达miR-16和KRAS的SW480细胞分别注射至小鼠皮下,4周后将小鼠处死,剥离出肿瘤,进行拍照称重,检测肿瘤中miR-16和KRAS的表达水平,并利用一部分组织进行HE染色和免疫组化实验。研究结果:临床水平实验:结直肠癌组织中KRAS蛋白水平明显升高,而其mRNA水平无明显变化。由于miRNA具有转录后调控机制,我们采用生物信息学软件筛选得出miR-16可能靶向调控KRAS的表达,且miR-16与KRAS mRNA的结合能为-24.2kcal/moL。进一步验证结直肠癌组织中miR-16的表达水平,结果发现在结直肠癌组织中miR-16的表达水平明显降低。细胞水平实验:荧光素酶报告实验结果显示将野生型报告质粒和mi R-16类似物同时转入结直肠肠癌细胞中,荧光素酶活性明显受到抑制,相反,将野生型报告质粒和miR-16抑制剂同时转入细胞中,荧光素酶活性升高,而同突变型报告质粒一同转入miR-16类似物或抑制剂,则不影响荧光素酶活性,这就说明miR-16可靶向调控KRAS的表达;检测SW480、HT-29及Caco2细胞中mi R-16的表达水平发现,SW480及HT-29细胞中miR-16的水平明显低于Caco2细胞中。于是我们在SW480及HT-29细胞中转染pre-miR-16,在Caco2细胞中转染anti-miR-16来实现miR-16表达的上调或下调。Western Blot结果证实miR-16表达上调后,KRAS蛋白表达水平下降;miR-16下调后KRAS蛋白表达水平升高。qRT-PCR结果显示KRAS mRNA表达水平无明显变化;向细胞中转染miR-16类似物后可抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭并诱导其凋亡,而转染过表达KRAS的质粒后则可促进细胞的增殖和侵袭并抑制其凋亡。动物水平实验:与对照组相比,过表达mi R-16组的肿瘤体积总体减少达到80%,miR-16表达升高,KRAS蛋白表达降低,KRAS mRNA水平无明显变化;KRAS过表达组的结果则与mi R-16过表达组相反;同时过表达miR-16和KRAS组,KRAS可部分回复mi R-16的作用。研究结论:在结直肠癌中,miR-16可通过靶向调控KRAS的表达发挥抑制肿瘤生长的作用。