目的：肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，其本质是以胶原为主的ECM合成增多，而降解相对减少，两者失去动态平衡，致使过多ECM沉积于肝内，ECM中主要成分是胶原，而胶原中以Ⅰ型胶原蛋白为主，现已证明HSC激活是产生Ⅰ型胶原导致纤维化发生发展的中心环节。RNA干扰(RNAi)是一种能达到特异性抑制目的基因表达的现象，己成功地下调了一些内源性基因的表达。我们目的是通过构建表达COL1A1小干扰RNA(siRNAs)的质粒，筛选出对肝星状细胞中Ⅰ胶原有影响序列。 方法： 从NCBI网站获得大鼠的COL1A1cDNA序列，根据Whitehead研究所的siRNA设计软件设计3条理论上最佳的siRNA序列，相应的双链DNA被插入pGPU6/GFP/Neo质粒中，即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C。为了得到高效沉默COL1A1-siRNA，以脂质体LipofectAMINE2000将各组siRNA1μg、2μg、3μg、4μg转染含荧光蛋白(GFP)质粒于HSC-T6细胞中，观察转染效果。然后，将最佳沉默siRNA剂量导入HSC-T6细胞，转染后24h传代，加入G418进行筛选，2周后挑取单克隆株扩大培养。获得稳定表达细胞系，分别建立表达pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C和阴性对照的单克隆大鼠肝星状细胞株。应用RT-PCR分析pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-N组的COL1A1mRNA的表达水平。 结果： 靶向COL1A1mRNA的3个shRNA重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C经测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致，经酶切凝胶电泳证实载体构建成功．观察1μg、2μg3μg、4μg组转染效果分别为16.7％、20.3％、23.5％、22.3％，以2ug siRNA为最佳剂量，RT-PCR分析pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C，对COL1A1mRNA的抑制率分别为16.6％、63.3％、80.3％。 结论： 筛选出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C表达质粒能高效地抑制转染细胞COL1A1mRNA的表达，从而为肝纤维化治疗提供新的方法和材料。