背景头颈部鳞状细胞癌是全球常见的恶性肿瘤之一,发病率高,死亡率高,预后极差。由于头颈部组织构造的隐秘性,患者就医时往往已经处于进展期。目前,临床上对于头颈癌的治疗方案仍以手术切除为主。头颈部集中了很多功能性器官和神经,主要完成呼吸,吞咽,发声等生理功能,手术切除伴随着生理功能的损伤,严重降低了患者的生存质量,而术后的多种并发症包括咽瘘、失声更是不容忽视。近些年来,诱导化疗作为头颈癌治疗新方案的研究越来越多,患者经过诱导化疗后可进行后续治疗方案的选择,如对于化疗敏感的患者可选用化疗的方式继续治疗,避免了手术切除带来的种种术后并发症,这一治疗方案可极大的保留患者的器官功能,大大的提高了头颈癌患者的生存质量。然而化疗药物的非靶向性使其对于正常组织也具有杀伤作用,在治疗的同时往往伴随着强烈的毒副作用,例如应用在头颈癌治疗中的铂类药物洛铂,其胃肠道副反应和心脏毒性等毒副作用,限制了其在临床治疗头颈癌的应用。因此,根据头颈癌的治疗现状,亟待开发具有良好靶向性的载药载体用以靶向治疗头颈癌,以提高化疗药物洛铂在头颈癌患者中的治疗效率,并降低化疗药物带来的毒副作用。外泌体(Exosomes,EXO),茶托状磷脂双分子层囊泡,直径大小约为30-150nm,携带RNA,蛋白质等信号物质,在细胞间交流中担负重要角色,近些年来,外泌体作为生物体内信号传递的使者和靶向载药载体的研究层出不穷。多项研究结果表明,生物体内的细胞都可分泌外泌体如干细胞,树突状细胞等,外泌体可稳定的存在于生物体内如血液、乳汁、唾液等体液中,外泌体由于其自身的性质使得其拥有卓越的生物稳定性,越来越多的研究者选择改造外泌体使得其可包载多种具有治疗效应的物质例如RNA,蛋白质,化疗药物可用于多种疾病的治疗。在本研究中,我们选择外泌体作为靶向运输工具,利用近红外荧光分子成像技术,对头颈癌肿瘤进行诊断和治疗。利用TRP-PK1多肽可以自主插入脂质双分子层的特点,将iRGD结合在TRP-PK1的N-端,形成TRP-PK1-iRGD多肽,用以修饰外泌体,使其具有靶向高表达αvβ3整合素的肿瘤组织的作用。洛铂药物通过共孵的方式包载至靶向修饰后的外泌体中,通过静脉注射的方式给药,精准靶向追踪肿瘤位置,释放化疗药物杀灭肿瘤细胞,最大程度上实现降低化疗药物对正常组织的损伤,降低毒副作用,提高治疗效率。在本研究中,通过改造天然外泌体装载化疗药物使其能够靶向治疗肿瘤,在提高化疗药物治疗效率的同时,降低化疗药物的毒副作用,为头颈癌治疗提供新的方法。目的1.通过TRP-PK1-iRGD多肽修饰外泌体使其能够靶向头颈部癌组织,并通过分子影像技术检测改造后外泌体且偶联近红外染料在体内分布和代谢特点。2.通过修饰后外泌体包载化疗药物洛铂靶向作用于肿瘤组织,提高化疗药物洛铂在头颈部鳞状细胞癌中的治疗效果,减少化疗药物洛铂带来的毒副作用。方法1.实验材料:外泌体,iRGD peptide,TRP-PK1 peptide,IRDYE800CW-NHS-easter,注射用洛铂。2.生物材料:头颈癌细胞系HN4-luc cells,人胚肾细胞系HEK293T cells,细胞培养液,Balb/c裸鼠,生物基质胶,荧光素底物酶。3.实验设备:超速离心机,马尔文电位仪,倒置荧光显微镜,共聚焦显微镜,透射电子显微镜,体式荧光显微镜,酶标仪,小动物麻醉装置,IVIS小动物活体成像系统。4.提取外泌体,实验中所用外泌体均取自人胚肾细胞系HEK293T cells细胞培养上清液中,人胚肾细胞系HEK293T cells用含10%FBS的DMEM正常培养,提取外泌体48h前用无FBS DMEM处理,处理结束后,收集细胞培养上清液,采用超速离心的方法提取外泌体,马尔文粒度仪检测所提外泌体的水合粒径大小,生物透射电镜观察所提外泌体的形态结构特征,Western Blotting方法检测所提外泌体的特异性标志物的表达。TRP-PK1通过其主动插入磷脂双分子内的特性将iRGD锚定在外泌体膜上,iRGD通过活化N端连接近红外荧光染料IRDYE800CW-NHS-easter,然后将洛铂药物与接有靶向肽段和荧光染料的外泌体室温共孵30 min,离心去除未包载化疗药物后,PBS重悬,得到改造后的外泌体。5.细胞培养和种植:头颈癌细胞系HN4-luc cells,人胚肾细胞系HEK293T cells在标准条件下培养。Balb/c裸鼠从北京维通利华动物中心购买,并按照动物中心饲养要求饲养。裸鼠皮下瘤模型的建立取50只6-8周雄性Balb/c裸鼠,1:1混合生物基质胶和头颈癌细胞系HN4-luc cells细胞悬液,每只裸鼠腋部皮下接种约2×106头颈癌细胞系HN4-luc cells细胞悬液,建立裸鼠皮头颈癌移植瘤模型。6.改造后外泌体在活体内的生物分布:改造后外泌体在裸鼠体内的组织分布是通过小动物荧光成像设备IVIS检测IRDYE800CW-NHS-easter的荧光分布来确定。将改造后外泌体通过尾静脉注射的方式注入到裸鼠体内,通过IVIS的实时检测,观察改造后探针在体内的生物分布,代谢途径,记录改造后外泌体在肿瘤部位富集最多的时间点并测定记录各组织荧光强度。7.活体水平评估改造后外泌体的治疗效果。通过尾静脉注射方式给药,给药后每两天称量裸鼠的体重、测量肿瘤大小、记录生存时间,治疗18天后,整合数据以体重,肿瘤体积大小和生存曲线等参数对不同组别改造后外泌体的治疗效果进行评估。结果细胞水平和动物水平的结果显示TRP-PK1肽段可以将iRGD肽段锚定在外泌体膜上,赋予外泌体靶向肿瘤细胞表面整合素的作用,保证外泌体包载洛铂药物可以靶向肿瘤发挥治疗作用。静脉注射修饰后外泌体包载的洛铂药物治疗组EXO(TRP-PK1-iRGD)+LBP与游离洛铂药物组相比,都能有效的抑制肿瘤增长的速度。结果显示,静脉注射改造后外泌体的治疗组EXO(TRP-PK1-iRGD)+LBP与静脉注射游离洛铂药物组对比,修饰后外泌体包载的洛铂药物治疗组EXO(TRP-PK1-iRGD)+LBP的裸鼠体重在治疗过程相对稳定,未出现体重急剧下降的现象。实验结果说明改造后外泌体可以提高洛铂化疗药物的治疗效果,并明显的降低了洛铂化疗药物的毒副作用结论改造后外泌体包载洛铂化疗药物可有效的靶向杀灭肿瘤细胞,不仅可以达到良好的治疗效果,并且在治疗的同时还能够减少洛铂化疗药物对正常组织的伤害。因此,我们猜想,如果在后续的研究中能够提高外泌体包载药物的效率,可更加显著的提高治疗效果。改造后外泌体的靶向性决定了化疗药物的毒副作用,因此,我们猜想,如果能够提高外泌体的靶向性,则极有可能大大降低外泌体所载化疗药物的各种毒副作用。