多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类分布广泛的难降解有机污染物,其具有急慢性毒性作用,甚至具有致畸、致癌、致突变的能力,因此,其对环境的污染和危害已经成为一个备受关注的问题。微生物降解PAHs是一种经济、高效的PAHs污染治理方式。微生物所产生的酶在降解PAHs的过程中起关键作用。而污染环境中常与PAHs共存的重金属能通过影响微生物的生长及产酶或酶促降解过程对PAHs的生物降解造成影响。在实际应用中,由于游离态的微生物容易在与本土微生物进行恶性竞争中失去降解优势,同时也由于难以适应现实恶劣的自然环境而降低对PAHs的处理效率。而利用固定化技术将微生物进行包埋固定后,微生物将会固定在聚合体形成的基质内部,这样的聚合微环境能提高微生物密度,使得微生物抵御环境影响的能力增强,同时还可以将微生物重复再利用,以此提高对PAHs的降解能力。现在已有越来越多的研究关注到固定化微生物降解PAHs的应用,但有关于固定化微生物处理PAHs的机理研究还尚不明晰,特别是在重金属与PAHs共存的情况下。在微生物处理PAHs与重金属复合污染时,由于PAHs和重金属都会对微生物带来生理生化方面的影响,给微生物带来氧化损伤或使得微生物具有抗性。因此研究微生物在固定化前后对PAHs和重金属的生理响应和解毒机制,能为提高微生物的处理效率及固定化技术在微生物处理PAHs和重金属复合污染研究中起到重要作用。同时,将微生物与生物炭联用,发挥二者的协同作用,对于经济高效地将微生物应用于土壤环境的修复具有重要意义。因此,本研究以高效降解菌Bacillus sp.P1为实验对象,探究了重金属胁迫下游离态Bacillus sp.P1降解菲的过程及酶学反应变化,然后通过固定化技术将Bacillus sp.P1进行处理,比较了固定态及游离态菌株在重金属胁迫下处理PAHs的差异,通过分析Bacillus sp.P1的生理响应及解毒机制,阐明了固定化作用对重金属胁迫下菌株处理PAHs的影响机理。最后将生物炭与Bacillus sp.P1通过固定化技术联用,用于菲和镉污染土壤的处理,研究结果将为微生物在PAHs和重金属复合污染修复中的应用提供理论指导。本研究的具体工作及成果主要可归纳为以下四个方面:第一部分探究了Pb(II)和Cd(II)胁迫下游离态Bacillus sp.P1降解菲的过程及酶学反应变化,分析了Pb(II)和Cd(II)对Bacillus sp.P1降解菲的降解途径及降解能力的影响,同时通过SDS-PAGE分析法探究了重金属胁迫下Bacillus sp.P1降解菲时所产胞外、胞内分泌物中蛋白的组成、浓度的变化,通过测定其中的关键开环酶邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活的变化,研究了重金属对Bacillus sp.P1分泌物酶活性的影响。在比较胞外、胞内酶酶促降解效率时考究了其最优降解的pH及温度。整体上而言,重金属离子Pb(II)和Cd(II)均抑制了Bacillus sp.P1对菲的降解,且Cd(II)的抑制作用大于Pb(II)。Pb(II)和Cd(II)不改变Bacillus sp.P1降解菲的邻苯二甲酸途径,仅影响各组分的浓度。重金属影响Bacillus sp.P1降解菲过程中酶学性质主要表现在,随Pb(II)浓度增大,胞外和胞内分泌物中的总蛋白含量及33-45 kD分子量蛋白含量均呈现先增大后减小的趋势。而随Cd(II)浓度增大,胞外、胞内分泌物中蛋白总浓度及含邻苯二酚2,3-双加氧酶的33-45 kD蛋白的浓度依次减小。Pb(II)对Bacillus sp.P1胞外及胞内粗酶液中邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活的影响存在低浓度促进、高浓度抑制的作用。而Cd(II)对Bacillus sp.P1胞外及胞内粗酶液中邻苯二酚2,3-双加氧酶的酶活呈现抑制作用。在较佳pH和温度下,低浓度Pb(II)对菲的酶促降解有促进作用,而高浓度Pb(II)则会抑制菲的酶促降解。而Cd(II)的出现抑制了菲的酶促降解,且Cd(II)浓度越大,抑制作用越为显著(P<0.05)。第二部分利用固定化技术对Bacillus sp.P1进行处理,探究了聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)固定Bacillus sp.P1的最优实验条件,检验了固定化凝胶菌球的可重复利用性,比较了灭活固定化菌和游离态菌对镉胁迫下对PAHs(菲和芘)吸附的影响差异、动力学方程、菌体表面性质差异,同时关注了固定化作用对pH、温度、不同重金属及PAHs降解中间产物菲醌等影响因素的屏蔽作用。研究结果表明,固定菌球的PVA、SA和生物接种量的最优水平分别为12%、0.3%和10 mL。固定后,由于菌体表面的孔状结构更多,这些孔状可以显著增大污染物的吸附位点,提高生物可利用性,因此对菲和芘的去除效率相较于固定前的去除效率更高更快。固定态灭活Bacillus sp.P1及游离态灭活Bacillus sp.P1对菲和芘的吸附过程符合准二级动力学方程,且菲的符合度高于芘吸附的符合程度。分析动力学参数发现,固定后,菲的吸附速率有所下降,但吸附量增大,而芘的吸附速率和吸附量均有所增大。但芘的吸附量及吸附速率较菲的吸附而言,变化更小。固定化Bacillus sp.P1菌球可以多次回收并用于菲的降解,重复利用性较高。固定后,Bacillus sp.P1耐环境冲击性增强,对pH、温度的适应性更广,对重金属及PAHs降解中间产物等毒害物质的屏蔽能力增大。固定化载体保护了菌体,增强了对菲的降解能力。第三部分从Bacillus sp.P1菌体细胞的角度出发,探究了Cd(II)胁迫下Bacillus sp.P1降解菲时的生理响应及解毒机制,比较了固定化前后菌体生物量、总蛋白、解毒指标SOD、CAT及GSH的变化,分析了重金属富集量与解毒指标之间的相关性以及胞外分泌物与重金属浓度的变化关系,进一步阐明了Cd(II)胁迫下固定化作用对Bacillus sp.P1在降解菲时存在差异性的原因。研究结果表明,PAHs和重金属给Bacilllus sp.P1带来氧化损伤后,菌体会产生一系列的生理响应及解毒机制抵抗氧化损伤,当损伤不能缓解时,细胞会受到伤害,甚至出现菌体灭亡的情况。实验发现,固定后,Bacilllus sp.P1生物量较固定前更大,解毒指标SOD、CAT及GSH都较固定前有较大变化。这三者都会随菌体内重金属的富集量变化而变化,其中SOD活力对Cd(II)胁迫的敏感度最高。固定化载体对Bacilllus sp.P1的外排解毒机制有一定的促进作用。固定化载体将胞外多糖等物质固定在细胞周围,以吸附Cd(II),从而减小Cd(II)的污染,因此,随着随时间推移,固定态Bacilllus sp.P1较游离态Bacilllus sp.P1细胞的胞外总糖含量更高,而反应体系中Cd(II)浓度也更小。糖类物质有利于络合环境中的重金属,而蛋白类物质(如酶)对于分解环境中的有机污染物会起到积极作用,因此固定后胞外蛋白含量浓度较游离态的蛋白浓度更大。第四部分将Bacillus sp.P1与生物炭联用,并利用固定化技术将Bacillus sp.P1固定在生物炭上,使二者发挥协同作用,共同处理菲-镉污染土壤,通过探讨Cd(II)对生物炭修复土壤吸附菲的影响、动力学方程以及pH对Cd(II)胁迫下生物炭修复土壤吸附菲的影响,了解了生物炭单独作用对菲-镉污染土壤处理的效果,同时比较了Bacillus sp.P1及生物炭单独作用及利用固定化技术将二者联合作用时对土壤中菲和镉的去除效果,总结了微生物与生物炭交互作用的机理。实验结果表明,生物炭修复土壤对菲的吸附效率随时间延长而增加,约在4 h内达到吸附最大值,随后开始解吸过程,在24 h达到吸附平衡。菲和Cd(II)的吸附存在竞争作用。生物炭修复土壤对菲的吸附过程符合准二级动力学方程。Cd(II)胁迫下,生物炭修复的土壤对菲的的吸附速率有所降低。pH对Cd(II)胁迫下生物炭修复土壤吸附菲的影响较大,碱性条件利于菲的吸附,中性环境下菲的吸附率最低。Cd(II)的添加使得酸性条件下菲的吸附量减小,而弱碱性环境中,菲的吸附量增大。游离态Bacillus sp.P1单独添加进土壤处理菲-镉污染时,其对菲的降解效果并不理想,对重金属的处理能力较弱。利用生物炭固定Bacillus sp.P1会使得生物炭与Bacillus sp.P1产生协同作用,有利于菲的污染修复,但生物炭与Bacillus sp.P1的联用对于土壤中Cd(II)的总量降低及可利用态Cd(II)的减小上略逊色于生物炭单独作用。