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背 景:视网膜新生血管性眼病(neovascularretinopathy)已逐渐成为世界范围内的主要致盲性眼科疾病。一方面,生长因子在视网膜新生血管形成中的重要作用已得到广泛认可,通过玻璃体腔注射以促血管生成因子为靶点的药物可在一定程度上抑制新生血管的生成。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)等是促进视网膜新生血管形成的两个关键因子,抗VEGF、抗FGF药物抑制视网膜新生血管生成已被多项研究证实,但国内外尚没有针对这两种因子同时进行眼部治疗的报道。另一方面,虽然玻璃体腔注射抗VEGF药物是目前治疗眼部新生血管性疾病的有效方法,但其存在并发症、副作用等问题,因此寻找不依赖VEGF的促新生血管生成的其他通路,以及高效、低损伤拮抗视网膜新生血管的治疗靶点尤为重要。而随着microRNA在眼部组织发育分化、细胞凋亡、代谢和损伤后再生等方面调控作用的发现,其在视网膜新生血管基因表达和功能调控中的机制越来越受到人们的关注。目 的:观察并研究玻璃体腔注射新型VEGF和FGF联合阻断剂VF28对氧诱导视网膜新生血管的抑制作用及可能的分子机制;检测氧诱导视网膜病变小鼠模型的microRNA表达谱,初步探讨其与视网膜新生血管形成的关系。方法:建立OIR小鼠模型。C57母、乳鼠,OIR小鼠在出生后7天(P7)时置于高氧处理的密闭氧舱中饲养5天,正常对照组在常氧下饲养。VF28药效研究实验中,OIR小鼠在P12出仓后,双眼经玻璃体腔注射低(0.5 μg)、高(1 μg)剂量VF28,以及VEGF trap(0.5μg)和FGF trap(0.5μg),并按照注射药物不同分组;正常对照组和模型对照组注射生理盐水,所有小鼠注射后在常氧状态下再饲养5天。P17时通过球后注射FITC-高分子量右旋糖酐行眼底荧光血管造影,制作视网膜铺片观察视网膜血管变化,测量视网膜无灌注区的相对面积;眼球石蜡切片的H&E染色检测视网膜新生血管细胞核的数目;采用Western blot检测视网膜中PEDF、VEGF和FGF蛋白含量的变化以期探明VF28拮抗视网膜新生血管的分子机制。另在MicroRNA表达谱分析实验中,OIR小鼠于P12出仓,在常氧状态下再饲养5天。P17日龄时,通过球后注射FITC-右旋糖酐行眼底荧光血管造影,测量视网膜中央无血管灌注区的相对面积;眼球石蜡切片的H&E染色检测突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核的数目;继而行microRNA芯片分析,检测具有差异表达的microRNA,再用实时聚合酶链反应进行验证。结 果:1.1)眼底荧光血管造影显示OIR小鼠视网膜出现无灌注区和大量排列紊乱的新生血管,以及迂曲扩张的视网膜静脉;各药物干预组无灌注区的相对面积显著低于OIR小鼠,VF28低、高剂量组和VEGF trap组对视网膜无血管灌注区的改善作用显著优于FGF trap组;值得注意的是,VF28低剂量组显著优于高剂量组;而且相同剂量的VF28(低剂量)组与VEGF trap组相比,无灌注区有下降的趋势,但无统计学意义。2)HE染色检测各组小鼠视网膜突破内界膜的新生血管内皮细胞核数结果显示,高氧处理后,小鼠视网膜新生血管内皮细胞核数较常氧组显著增加。VF28、VEGF trap和FGF trap干预组均可显著降低OIR小鼠视网膜新生血管内皮细胞核数,但以VF28 0.5μg/眼组效果最为明显,其效果显著优于VF28高剂量组,以及同剂量的VEGF trap组和FGF trap组,并且接近正常对照组。3)Western blot结果显示,PEDF和VEGF在OIR小鼠视网膜中呈相反的变化,表现为VEGF水平显著升高而PEDF显著降低;VF28(1μg/眼)和VEGF trap(0.5μg/眼)均能显著降低VEGF水平并使PEDF显著增加(P<0.001 vs模型组),VEGF trap对FGF的上调没有影响;FGF trap(0.5μg/眼)能显著降低FGF水平(P<0.05 vs模型组),而对VEGF的上调没有影响;VF28(1μg/眼)也能显著降低FGF水平。2.1)眼底荧光血管造影显示,正常对照组小鼠视网膜血管平滑、均匀有序分布;OIR组小鼠周边视网膜血管迂曲、紊乱并伴有新生血管芽,中央视网膜无灌注区明显。正常对照组、OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积分别为0、(25.81±2.12)%;OIR组小鼠视网膜中央无血管灌注区的相对面积与正常对照组相比明显增大,差异有统计学意义(t=28.71,P<0.001)。2)光学显微镜观察发现,正常对照组小鼠内界膜结构平滑、完整,血管及细胞排列整齐,偶见突破内界膜的血管内皮细胞核。正常对照组、OIR组平均每张切片血管内皮细胞核数分别为(0.16±0.31)、(28.41±4.01)个。两组平均每张切片血管内皮细胞核数比较,差异有统计学意义(t=54.45,P<0.001)。3)MicroRNA芯片分析结果显示,与正常对照组比较,OIR组有21个microRNA的表达发生了 1.5倍以上的变化。其中,上调者9个,下调者12个。差异表达倍数≥3.0的microRNA为miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c。RT-PCR 检测发现,差异表达倍数≥3.0的4个microRNA,其表达趋势与芯片分析结果一致。与正常对照组比较,OIR组miR-3078的表达明显上调,差异有统计学意义(t=-2.380,P<0.05);miR-140、miR-29b、miR-29c的表达明显下调,差异也有统计学意义(t=2.638,t=2.323,t=2.415,P 均<0.05)。结 论:1.VF28低剂量(0.5μg/眼)在OIR小鼠模型中,可有效改善视网膜无血管灌注区,显著降低视网膜新生血管细胞核数,对视网膜新生血管的抑制作用优于等剂量的VEGF trap和FGF trap。这些结果提示双靶点干预对视网膜新生血管的抑制作用优于相应的单靶点干预。VF28在OIR小鼠视网膜中的保护作用可能是由于其降低了促新生血管和促炎因子VEGF和FGF的有效浓度及其介导的信号传导通路,同时增加了保护性因子PEDF的表达而引起的。2.OIR 小鼠模型的 microRNA 表达谱中,miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c的差异表达倍数≥3.0,其可能与视网膜新生血管形成有关。