论文部分内容阅读
背景:胶质瘤是最常见的脑部恶性肿瘤,尽管目前在外科治疗及肿瘤基因治疗上取得了一些进展,但是总的来说其预后仍然很差,尤其是胶质母细胞瘤尚无有效的措施从根本上改善其预后。所以,深入研究其发生发展的细胞及分子机制具有重大现实意义。血管新生是生理性及病理性血管生成的主要形式,研究发现实体性肿瘤的生长高度依赖于血管的新生,因而关于血管新生与恶性肿瘤的发生、发展及转移的关系近年来已逐渐成为研究热点。目前国内外学者也进行了一系列针对肿瘤血管新生的实验及临床研究,并取得了一些可喜的成果。绝大部分脑胶质瘤属于实体性肿瘤,研究表明它亦具有高度血管化的的特征,它通过新生的血管供应必需的O2及营养物质而不断增殖并向周围组织侵袭。因此,抗血管生成是治疗胶质瘤极具希望的策略之一,但其血管新生的调节机制目前尚不太清楚,寻找和识别在这一过程中的关键性调控因子将是抗胶质瘤血管生成的有效途径,具有重要意义。EGFL7是一新发现的内皮细胞源性分泌性因子。它在胚胎及富血管组织存在高表达,而在大多数成熟组织中表达水平均很低。研究表明,当沉默EGFL7基因表达后胚胎血管形成过程中其血管不能形成管状结构,提示它是血管新生过程中的管状结构形成的关键调控因子。由于管状结构的形成对于新生血管发挥其正常功能至关重要,所以EGFL7将有望成为抗血管生成治疗的关键性靶点。目前关于EGFL7的报道研究尚不多,而且主要集中于胚胎发育及血管损伤等生理性血管新生方面。它在肿瘤等病理性血管新生中的表达及作用尚未见报道;在人脑胶质瘤中的表达及其作用机制目前国内外亦无相关研究报道。我们推测其在胶质瘤的血管生成中亦起着关键性调控作用,但是这一推测尚待在体内外胶质瘤模型中去研究证实。目的:探讨EGFL7基因在人脑胶质瘤组织中的表达情况;并通过RNAi沉默EGFL7基因在人胶质母细胞瘤细胞株U251及人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC中的表达,探讨了EGFL7在胶质瘤血管新生过程中的可能作用及机制。方法:收集36例新鲜胶质瘤标本,其中包括21例低度恶性（Ⅰ～Ⅱ级）及15例高度恶性者（Ⅲ～Ⅳ级）,用RT-PCR检测其EGFL7mRNA的表达。另收集45例胶质瘤石蜡标本,其中包括24例低度恶性（Ⅰ～Ⅱ级）及21例高度恶性者（Ⅲ～Ⅳ级）,用免疫组织化学检测EGFL7蛋白、Ⅷ因子及Ki-67的表达情况。并分析EGFL7蛋白的表达与胶质瘤的病理分级、胶质瘤Ki-67标记指数（LI）及微血管密度（MVD）的关系。构建针对人EGFL7的小RNA干扰序列以研究其对胶质瘤血管生成的影响:设计选取四对不同的RNAi序列及一对普适性阴性对照序列构建短发夹结构RNA,然后将其克隆入pGCL-GFP载体并进行PCR及DNA测序鉴定。同时,构建含有增强型绿色荧光蛋白报告基因（EGFP）的人EGFL7-flag过表达的重组质粒载体pEGFP-C1以用于外源性筛靶。用Lipofectamin脂质体法将重组pGCL-GFP及pEGFP-C1共转染293T细胞,然后用Western Blot检测各shRNA序列对EGFL7的基因沉默效率。选取基因沉默作用最明显的序列进行慢病毒包装,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7。通过检测GFP的表达来测定包装的慢病毒滴度。先用real-time quantitative PCR及免疫组织化学方法检测EGFL7 mRNA及其蛋白在人胶质母细胞瘤细胞株U251及人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC中的表达情况,然后用慢病毒载体pGCL-GFP-vshEGFL7感染该两种细胞。用real-time quantitative PCR验证shRNA对U251细胞及HUVEC中EGFL7基因的沉默作用。为研究体内胶质瘤微环境中肿瘤细胞对内皮细胞的作用,用Transwell技术体外建立了U251细胞与HUVEC共培养模型。然后沉默EGFL7基因表达,用MTT检测U251细胞及HUVEC的增殖活性;流式细胞仪检测HUVEC的细胞周期分布及凋亡率;结晶紫染色法检测HUVEC的粘附及迁移能力;体外毛细胞血管样结构形成实验分析HUVEC成血管能力变化。结果:①检测到EGFL7mRNA及其蛋白在人脑胶质瘤中存在表达,EGFL7蛋白表达主要定位于肿瘤细胞及血管内皮细胞的胞浆,且其表达与肿瘤的恶性程度（t=4.399,P＜0.01）,Ki-67 LI（r=0.793,P＜0.01）及MVD（r=0.684,P＜0.01）有明显的相关性;EGFL7在正常脑组织中没有表达。②含针对EGFL7的shRNA慢病毒载体pGCL-GFP及EGFL7真核过表达载体pEGFP-C1经PCR及测序鉴定完全正确;pEGFP-C1转染293T细胞后能够强烈表达报告基因EGFP;pGCL-GFP与pEGFP-C1共转染293T细胞后,Western Blot检测发现四对shRNA序列中,序列5′-CCGAACCATC7ATAGGACC-3′（512～530）对EGFL7基因特异性沉默作用最为显著;进行病毒包装后经检测干扰组及普适性阴性对照组慢病毒滴度分别为4.8×107TU/ml及5.0×107TU/ml以上。③U251细胞及HUVEC中均存在EGFL7mRNA及其蛋白的表达。EGFL7免疫阳性产物主要位于该两种细胞的胞浆中。与普适性对照及正常对照组相比,pGCL-GFP-vshEGFL7对U251细胞及HUVEC中EGFL7mRNA表达有显著的沉默作用（P＜0.01）;而两对照组之间无明显差异（P＞0.05）.④EGFL7基因沉默48h后,U251细胞的增殖活性亦明显低于普适性对照及正常对照组（P＜0.01）,而后两组无明显差异（P＞0.05）;EGFL7基因沉默对单纯培养的HUVEC增殖活性、迁移能力、细胞周期及凋亡率无明显影响（P＞0.05）;其对胶质瘤微环境中HUVEC迁移能力亦无明显影响（P＞0.05）,但是EGFL7基因沉默后48h至4d时HUVEC细胞增殖活性与两对照组相比明显下降（P＜0.01）,第5d后又恢复至正常（P＞0.05）;无论单纯培养还是与U251共培养,EGFL7基因沉默均可导致HUVEC的粘附能力明显下降,并且均不能形成毛细血管样结构,与普适性阴性对照及正常对照组相比差异显著（P＜0.01）,而后两组无明显差异（P＞0.05）。结论:1.人脑胶质瘤中肿瘤细胞及其血管内皮细胞均可表达EGFL7。HUVEC及U251细胞亦可合成和分泌EGFL7蛋白。在胶质瘤组织中EGFL7的表达与肿瘤恶性程度、KI-67 LI及MVD具有明显相关性。提示EGFL7在胶质瘤的生长、侵袭中发挥重要作用。2.本研究筛选出了针对人EGFL7基因的siRNA有效靶序列;并成功构建了针对EGFL7基因的慢病毒介导的shRNA载体;并证明该shRNA可显著地沉默U251细胞及HUVEC中EGFL7基因的表达。3.慢病毒介导的EGFL7基因沉默可以明显抑制HUVEC的粘附能力、成管能力及U251细胞的增殖活性。提示EGFL7在胶质瘤血管内皮细胞管状结构形成过程中起着关键性调控作用,并可直接促进肿瘤细胞的增殖活性。提示EGFL7可能是胶质瘤基因治疗一潜在靶点,并且以shRNA为基础针对EGFL7基因RNAi可能是一新的极具希望的治疗策略。