研究背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一,肿瘤转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。抗脱落凋亡增强了癌细胞在全身循环系统中的生存,从而促进远端器官继发性转移瘤的形成。微小RNA(micro RNA,miRNA)是由约21-25个核苷酸组成的内源性单链非编码小RNA,通过与靶m RNA的3’UTR碱基的部分互补配对,抑制m RNA翻译或直接使其降解,在转录后水平抑制靶基因的表达。最新研究结果证实,miRNA的异常表达在结直肠癌等众多恶性肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。miRNA-124是已知被报道具有多种抑癌功能的非编码微小RNA分子。然而,其在结直肠癌细胞脱落凋亡中的调控作用和机制尚不清楚。乳腺癌分子亚型的分类提高了临床预后评价的准确性和治疗策略的有效性。然而,由于乳腺癌的高度异质性,需要探索更多的生物标志物和功能分子来为精准诊疗提供支持。既往研究结果证实miRNA-139在多种恶性肿瘤中发挥着重要的抑癌生物学作用,但其在乳腺癌,尤其是不同分子分型乳腺癌中扮演的角色鲜有报道。DNA拓扑异构酶在DNA复制中发挥着至关重要的生物学功能。现在已知,TOP2a与多种人类恶性肿瘤细胞的异常增殖密切相关,TOP2a的高水平表达也是预示患者生存期缩短的重要指标。临床上常用的蒽环类化疗药物的主要靶标就是TOP2a。但是在对不同分子亚型的乳腺癌患者的药物干预过程中,患者的反应性却存在巨大差异,深入分析TOP2a在不同分子分型乳腺癌患者中的生物学贡献、预后评判价值和治疗学意义就显得尤为关键。研究目的:1.观察miR-124对人结直肠癌细胞脱落凋亡敏感性的影响;2.分析miR-124调节结直肠癌细胞脱落凋亡敏感性的具体分子机制;3.观察ITGA3对结直肠癌细胞脱落凋亡敏感性的影响;4.分析ITGA3表达水平与结直肠癌患者预后之间的临床意义;5.分析TOP2a的表达水平与各种分子分型乳腺癌患者预后的相关性;6.观察TOP2a分子对管腔型乳腺癌细胞的生物学作用;7.证实miRNA-139对TOP2a表达水平的负向调节作用;8.观察miRNA-139对管腔型乳腺癌细胞增殖能力的调控作用;9.明确TOP2a在miRNA-139抑制管腔型乳腺癌细胞增殖能力中的生物学作用。研究方法:1.利用p Lenti6.3慢病毒感染和抗性药物筛选的方法建立过表达miR-124的结直肠癌细胞系(Lv-miR124–Lovo和Lv-miR124–SW620);利用q RT-PCR方法检测表达水平miR-124在肿瘤细胞中的过表达水平;进而采用台盼蓝拒染实验、活性caspase-3检测实验明确过表达miR-124在细胞培养条件下对结直肠癌细胞脱落凋亡敏感性的影响;利用裸鼠尾静脉注射瘤细胞的方法建立结直肠癌体内转移瘤模型,使用HE染色等形态学方法观察在体内环境下过表达miR-124对结直肠癌细胞转移的影响。2.利用生物信息学分析软件初步预测miR-124在结直肠癌细胞中的可能下游靶基因(ITGA3);利用荧光素酶报告基因实验明确ITGA3是否是miR-124的新的下游靶基因;利用Westenr blot和q RT-PCR等方法明确过表达miR-124对结直肠癌细胞内源ITGA3表达的影响。3.用p LKO-sh RNA慢病毒感染系统和抗性药物筛选的方法获得稳定下调ITGA3的结直肠癌细胞株;利用Westenr blot方法确认ITGA3基因干涉效果;使用台盼蓝拒染实验、活性caspase-3检测实验观察下调ITGA3表达在细胞培养条件下对结直肠癌细胞脱落凋亡敏感性的影响;利用裸鼠尾静脉注射瘤细胞的方法建立结直肠癌体内转移瘤模型,使用HE染色等形态学方法观察在体内环境中下调ITGA3表达水平对结直肠癌细胞转移的影响。4.利用两个结直肠癌患者独立队列分析ITGA3 m RNA的表达水平与患者预后之间的相关性。5.利用来自于乳腺癌预后分析的开放数据库Kaplan-Miemer Plotter对TOP2a表达水平与乳腺癌患者的预后进行分析评价。6.用p LKO-sh RNA重组慢病毒干涉系统获得两株稳定下调TOP2a的管腔型乳腺癌细胞系(MCF-7和T47D);利用Westenr blot方法确认基因干涉效果;采用MTT实验、平板克隆形成实验观察下调TOP2a表达水平对乳腺癌细胞增殖能力的影响。7.利用生物信息学分析软件分析miR-139在结肠癌细胞中的可能下游靶基因(TOP2a);使用荧光素酶报告基因实验明确TOP2a是否是miR-139的新的下游靶基因;利用Westenr blot和q RT-PCR等方法明确过表达miR-139对乳腺癌细胞内源表达TOP2a的影响。8.利用重组慢病毒系统建立过表达miR-139的管腔型乳腺癌细胞系(MCF-7和T47D);利用q RT-PCR方法确认miR-139的过表达情况;使用MTT实验、平板克隆形成实验观察过表达miR-139对管腔型乳腺癌细胞增殖能力的影响。最后用METABRIC乳腺癌样品数据库分析miR-139的表达水平与各种分子分型乳腺癌患者生存率之间的关系。9.利用重组病毒表达系统在过表达miR-139的管腔型乳腺癌细胞系(MCF-7和T47D)中导入外源TOP2a;用Western blot实验检测细胞中外源TOP2a表达水平;使用MTT和平板克隆形成实验观察乳腺癌细胞增殖能力的变化。研究结果:1.慢病毒稳定感染miR-124的Lovo和SW620细胞与对照组细胞相比,miR-124的表达量分别提高了320倍和452倍,说明建系成功。台盼蓝拒染实验结果,两组过表达miR-124细胞系的细胞凋亡比例分别是对照组的3.12倍和4.18倍,活性caspase-3检测实验结果显示,两组过表达miR-124细胞系中caspase-3的相对活性是对照组的2.51倍和3.12倍。体外实验中,我们检测裸鼠肺组织,观察到在过表达miR-124的细胞组中,肺转移肿瘤结节的数量、体积和发生频率均少于对照组。2.基因3’UTR报告基因结果显示,转染miR-124可以抑制野生型ITGA3-3’UTR’光素酶活性。但对含有miR-124理论结合位点突变的ITGA3-MUT-3’UTR荧光素酶活性则无抑制作用,说明miR-124直接与此结构结合。同时,Westenr blot和q RT-PCR方法显示,过表达miR-124可以显著抑制结肠癌细胞内源ITGA3在蛋白水平和m RNA水平的表达。3.我们利用p LKO-sh RNA慢病毒感染系统和抗性药物筛选后,用Westenr blot检测两株结直肠癌细胞系(Lovo和SW620)中ITGA3的表达水平,均较对照组明显下降,说明建系成功。台盼蓝拒染实验结果显示,在两种下调ITGA3表达的细胞系中,脱落凋亡细胞的比例分别是对照组的4.67倍和6.02倍;活性caspase-3检测实验结果显示,在两种下调ITGA3表达的细胞系中,caspase-3的相对活性分别是对照组的3.98倍和5.12倍。在体内转移瘤模型实验中,我们检测裸鼠肺组织,观察到在两组下调ITGA3表达的实验组中,肺转移肿瘤结节的数量、体积和发生频率均少于对照组。4.通过结直肠癌患者队列分析,我们发现ITGA3的高水平表达与患者预后不良密切相关。5.通过对Kaplan-Miemer数据库的分析,我们发现TOP2a的高表达与乳腺癌患者无病生存率和总生存率呈现反相关关系。而在对不同分子分型乳腺癌患者预后的分析中,我们发现TOP2a的高表达只与管腔型乳腺癌患者的预后不良密切,而与基底细胞型和HER2阳性乳腺癌患者的预后无明显统计学意义。6.我们利用慢病毒干涉系统下调TOP2a的表达,用Westenr blot检测两株管腔型乳腺癌细胞系(MCF-7和T47D)中TOP2a的表达水平,均较对照组明显下降,说明建系成功。MTT实验结果显示,两种下调TOP2a表达细胞系的细胞生长速度较对照组明显降低。平板克隆实验结果显示,两种下调TOP2a表达细胞系的克隆形成能力受到明显抑制。7.基因3’UTR报告基因结果显示,转染miR-139可以抑制野生型TOP2a-3’UTR荧光素酶活性,但对含有miR-139理论结合位点突变的TOP2a-MUT-3’UTR荧光素酶活性则无抑制作用,说明miR-139直接与此结构结合。Westenr blot和q RT-PCR结果显示,过表达miR-139能够显著抑制乳腺癌细胞内源性TOP2a在m RNA和蛋白质水平的表达。8.我们利用重组慢病毒系统建立了miR-139过表达的MCF-7和T47D细胞,与对照病毒感染组相比,miR-139的表达量分别提高了212倍和98倍,说明建系成功。MTT实验结果显示,两种过表达miR-139细胞系的细胞生长速度较对照组明显降低。同时,平板克隆实验结果也显示,两种过表达miR-139细胞系的克隆形成能力受到明显抑制。9.我们利用重组逆转录病毒系统在miR-139过表达的管腔型乳腺癌细胞系(MCF-7和T47D)中导入外源TOP2a,Western blot实验确认了外源TOP2a得到了成功的过表达。MTT实验结果显示,两种恢复TOP2a细胞系的细胞增殖能力较对照组增强。同时,平板克隆实验结果显示,两种过表达miR-139细胞系的克隆形成能力受到了显著的抑制。研究结论:1.我们发现在人结直肠癌细胞系中过表达miR-124可以提高结直肠癌细胞的脱落凋亡敏感性;整合素分子ITGA3是miR-124在结直肠癌细胞中的一个新的下游靶分子;在结肠癌细胞中下调ITGA3的表达能够促进结肠癌细胞的脱落凋亡,进而抑制远处脏器转移;ITGA3的高表达与结直肠癌患者预后不良密切相关。综上,本研究证实了miR-124/ITGA3调节轴的失衡很可能是结直肠癌远处脏器转移和患者预后不良的重要分子事件,从而为转移性结直肠癌的预后分析和治疗学研究提高重要的实验依据。2.在乳腺癌的研究中,我们发现miR-139可以抑制管腔型乳腺癌细胞的增殖能力;TOP2a是miR-139在乳腺癌细胞中的一个新的下游靶分子;在肿瘤组织中miR-139直接下调了TOP2a的表达,进而抑制了癌细胞增殖能力;TOP2a的高表达与管腔型乳腺癌患者预后不良密切相关。综上所述,我们提出miR-139/TOP2a调节轴对管腔型乳腺癌细胞增殖作用的影响,这一研究结论为我们深入理解乳腺癌分子类型特异性和建立更加精准的治疗策略提供重要的理论基础和实验依据。