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油菜杂种优势利用途径很多,主要有两类:细胞质雄性不育和细胞核雄性不育。由于核不育,特别是隐性核不育,在杂种优势利用中的优越性,最近几年相继在玉米、水稻等作物上,通过转基因技术,创建了新型核不育利用途径。关键技术是获得花粉粒特异表达启动子。基于此,本研究首先从油菜中鉴定了一个花粉优势表达基因,并通过启动子的截短等多种方法鉴定了启动子的功能区域和它的一个反式作用因子,并将截短后的花粉特异表达启动子片段应用于油菜隐性核不育系S45A的转基因保持系的创建。主要研究结果如下:1.油菜小肽基因Bna.SP6的鉴定在中双11中,我们克隆了ATSP6的2个同源基因Bn SP6_C08(611 bp)和Bn SP6_A08(475 bp),同时从花药c DNA中克隆了它们的编码区(246 bp)序列,命名为BnaC.SP6和Bna A.SP6。该编码区都编码一个包含81个氨基酸残基的小肽前体,它们不包含任何已知功能的结构域,而且N端都含有25个氨基酸的信号肽。RT-PCR和GUS染色结果表明BnaC.SP6是一个油菜晚期花药和角果假隔膜表达的小肽基因。2.启动子pBnaC.SP6的截短分析运用Plant CARE进行启动子元件的预测分析,在启动子pBnaC.SP6内发现一些已知的花粉特异表达元件,如POLLEN1LELAT52、LAT enhancer element和GTGA MOTIF,这些元件的存在可能有助于BnaC.SP6在晚期花药的花粉中优势表达。为了鉴定pBnaC.SP6的功能区域,5‘-端截短(p643、p447、p375、p306、p210和p135)及3‘-端截短(p254和p158)启动子片段的表达载体分别转入野生型拟南芥col。GUS染色表明pBnaC.SP6的-447至-375和-210至-135这2个区域分别控制BnaC.SP6在角果假隔膜和花粉中的表达。而且,半薄切片和DAPI染色证明pBnaC.SP6的最短的功能区域p158(-210至-52)可以驱动BnaC.SP6在2核花粉早期至成熟花粉中特异表达。比较测序发现花粉特异表达的p158在芸薹属作物中是高度保守的。3.Bna A.b ZIP1的表达模式及其转录因子特性qRT-PCR和GUS染色表明Bna A.b ZIP1在油菜花器官中动态表达,与BnaC.SP6共表达于花药中。因而从开放花药的c DNA中克隆了Bna A.b ZIP1的编码区(420 bp)序列。它编码了139个氨基酸残基,其17至68位氨基酸是一个具有二聚体功能与识别DNA元件的碱性亮氨酸拉链b ZIP结构域。将Bna A.b ZIP1的C端与绿色荧光GFP蛋白融合共转化原生质体细胞发现GFP信号与已经报道的核定位marker蛋白Os GHD7的青色荧光蛋白信号共定位,说明Bna A.b ZIP1是一个核定位蛋白。X-Gal染色和双分子荧光素酶报告分析(DLR)证实Bna A.b ZIP1具有转录激活能力,且C端是其激活能力所必需的。4.BnaC.SP6的转录调控启动子元件分析发现,在p158内包含了一个C-box(CACGTC)和一个ABRE motif(TACGTG)。酵母单杂交实验表明Bna A.b ZIP1只与C-box结合,但不与ABRE motif结合。除此之外,凝胶阻滞电泳和DLR分析进一步证实Bna A.b ZIP1特异通过C-box与p158结合。利用地塞米松诱导表达系统,在稳定转基因Bna A.b ZIP1/p158植株中证实Bna A.b ZIP1可以抑制p158在花粉中的活力。因此,Bna A.b ZIP1是BnaC.SP6的一个转录抑制子。这些结果首次证明了油菜小肽基因BnaC.SP6在花粉发育中的转录调控。5.启动子p158的利用基于BnaC.SP6的花粉特异表达的启动子片段p158与Bax,结合抗除草剂基因与恢复基因Bn MS1,构建了一个用于创建核不育系S45A转基因保持系的载体,转化油菜S45AB。通过测交初步确定1株S45A的潜在转基因保持系,但仍需在下一代进行测验。