结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）是结核病（tuberculosis,TB）的主要致病菌,其细胞壁具有致密结构,包括肽聚糖（Peptidoglycan,PG）,聚阿拉伯半乳糖（Arabinogalactan,AG）和分支菌酸（Mycolic acid,MA）,其中分支菌酸在保护MTB抵御药物和酸性环境的破坏方面发挥重要作用。结核分枝杆菌Rv3717蛋白是分子量为24.8 KD的一种细胞外分泌蛋白。最近报道表明,Rv3717具有N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶（N-acetylglucosamine,GlcNAc或NAG）活性,可以水解细胞壁肽聚糖^[1],是一类新型分枝杆菌自溶素,可能在结核病发生发展中发挥重要作用。无致病性的耻垢分枝杆菌（M.smegmatis mc²155,M.S）是MTB的模式菌,它们具有相似的细胞壁结构,耻垢分枝杆菌MSMEG₆281是Rv3717的同源蛋白。前期研究表明:Rv3717（MSMGE₆281）蛋白很可能在结核分枝杆菌分裂以及致病性方面发挥重要作用。因此,本论文拟通过MSMEG₆281基因敲除菌株的构建研究MSMEG₆281的功能,以推测Rv3717在结核病发生发展中的作用,为抗结核药物研发奠定基础。目的:本论文旨在探讨MSMEG₆281（Rv3717）在细菌生长、分裂、细胞壁生物合成以及分枝杆菌致病性中的功能,为结核分枝杆菌致病机制研究提供线索。方法:利用条件复制质粒通过两次同源重组成功构建MSMEG₆281基因敲除菌株,并利用RT-PCR对MSMEG₆281基因表达进行鉴定。通过生长曲线测定MSMEG₆281基因敲除对耻垢分枝杆菌生长的影响;抗酸染色以及细胞壁渗透性分析来检测细胞壁的完整性。利用透射电子显微镜技术（Transmission electron microscopy,TEM）观察MSMEG₆281基因敲除后对菌体细胞壁结构及细菌形态的影响。通过RT-PCR分析进一步研究MSMEG₆281基因敲除对细菌粘附素合成相关基因MSMEG₆396,MSMEG₆398,MSMEG₂078,MSMEG₃580表达变化。另一方面,利用气雾攻击法,以10⁸ CFU/ml的野生型耻垢分枝杆菌与M.sm-ΔM₆281感染小鼠,分别对两组小鼠进行气雾攻击平均每只鼠10⁸CFU/d,持续7天,检测小鼠肺部载菌量的变化。同时利用RT-PCR方法检测不同时间下小鼠脾组织的IL-6,IL-1β,IL-10的表达变化。结果:成功构建了MSMEG₆281基因敲除菌株,命名为M.sm-ΔM₆281。生长曲线检测表明,MSMEG₆281为耻垢分枝杆菌生长非必需基因。形态学分析表明:MSMEG₆281基因敲除后,菌体抗酸染色减弱,且细胞壁出现表面模糊,细胞边界不清晰,且呈锯齿状,说明MSMEG₆281基因敲除可能会影响细胞壁结构,影响细胞壁完整性。在细菌细胞壁通透性检测中,M.sm-ΔM₆281在SDS和结晶紫作用下无明显变化。RT-PCR检测表明,细菌粘附素合成相关基因MSMEG₆396和MSMEG₆398表达有下调趋势。动物实验研究表明,宿主对M.sm-ΔM₆281清除率增加,MSMEG₆281基因敲除后,引起脾组织细胞因子IL-6,IL-1β表达下调,因此,MSMEG₆281的同源基因Rv3717可能与结核分枝杆菌致病性相关。综上所述,耻够分枝杆菌生长非必须基因MSMEG-6281缺失,引起细菌形态及细胞壁结构变化,粘附素合成相关基因表达表达下调以及小鼠致病性下降,但不影响细菌的生长及细胞壁的渗透性。