第一部分miR-145调控肝癌腹水模型小鼠脾脏Th9细胞的分化及作用机制目的:研究miR-145激动剂对肝癌恶性腹水模型小鼠脾脏Th9细胞分化的调控作用以及可能存在的作用机制。方法:通过免疫磁珠法分选出正常小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,随机分为miR-145mimics组及阴性对照组,分别予miR-145mimics及阴性对照寡核苷酸进行干预,并在TGF-β和IL-4条件下诱导72h。复苏肝癌细胞系H22细胞,用磷酸缓冲盐溶液重悬至1×10~7/mL。经腹腔注射0.5mL H22细胞悬液建模。24小时后,将10只模型小鼠随机分为miR-145agomir组和阴性对照组,分别经鼠尾静脉注射mmu-miR-145-5pagomir和阴性对照寡核苷酸,3mg/kg,隔两天一次,共五次。造模两周后抽取肝癌腹水做腹水涂片及HE染色,颈椎脱臼法处死小鼠并分离出脾脏组织。RT-PCR法检测细胞及小鼠脾脏miR-145及PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、HIF-1αmRNA表达。流式细胞术分析细胞及脾脏Th9细胞比例。ELISA法检测脾脏和细胞上清IL-9以及脾脏HIF-1α表达。免疫荧光法检测细胞PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、HIF-1α表达。Western Blot法检测脾脏PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、HIF-1α相关蛋白表达。结果:与阴性对照组相比,miR-145mimics干预后的CD4+T细胞miR-145表达明显升高（P<0.05）,Th9细胞比例、IL-9mRNA及IL-9细胞因子表达降低（P<0.05）,HIF-1αmRNA及HIF-1α蛋白表达下调（P<0.05）,PI3K、Akt、p70S6K mRNA及蛋白表达均下降（P<0.05）。与阴性对照组肝癌恶性腹水模型小鼠相比,miR-145agomir组小鼠脾脏miR-145表达水平明显升高（P<0.05）,Th9细胞比例、IL-9mRNA及IL-9细胞因子表达降低（P<0.05）,HIF-1αmRNA及HIF-1α蛋白表达下调（P<0.05）,PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白磷酸化水平表达下降（P<0.05）。结论:miR-145激动剂抑制Th9细胞的分化可能与抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K/HIF-1α通路的激活相关。第二部分miR-145对肝癌腹水模型抑制作用的实验研究目的:检测肝癌恶性腹水模型小鼠脾脏IL-9R、JAK、STAT3、VEGFA表达,检测腹膜血管渗透性,测量腹水体积及观察生存时间,探讨miR-145激动剂对小鼠肝癌恶性腹水模型的抑制作用及可能机制。方法:利用肝癌H22细胞构建肝癌恶性腹水模型。24小时后,将30只模型小鼠随机分为miR-145agomir组和阴性对照组,分别经鼠尾静脉注射mmu-miR-145-5pagomir和阴性对照寡核苷酸,3mg/kg,隔两天一次,共五次。造模两周后,每组颈椎脱臼法随机处死小鼠5只,测量腹水体积,取出脾脏;每组随机抽取5只小鼠经鼠尾静脉注射0.2mL 5%的伊文蓝溶液;剩余小鼠观察生存时间。RT-PCR法检测脾脏IL-9R、JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、VEGFA mRNA表达。Western Blot法检测脾脏IL-9R、JAK、STAT3、VEGFA相关蛋白表达。酶标仪检测各组腹水上清液中伊文蓝的吸光度值。结果:与阴性对照组相比,miR-145agomir组IL-9R mRNA及IL-9R蛋白表达降低（P<0.05）,JAK1、JAK3、STAT3、VEGFA mRNA表达下降（P<0.05）,JAK、STAT3、p-STAT3、VEGFA蛋白表达下调（P<0.05）。miR-145agomir组腹水上清液吸光度值为2.38±0.01较对照组2.51±0.02明显降低（P<0.05）。miR-145agomir组及阴性对照组小鼠腹水体积分别为11.16±0.60 mL、13.92±0.70 mL（P<0.05）。miR-145agomir组小鼠生存时间为19.20±0.57 d,较对照组17.20±0.57 d明显延长（P<0.05）。结论:miR-145激动剂可以抑制肝癌腹水模型小鼠脾脏IL-9R表达,影响下游JAK/STAT3通路的激活,下调VEGFA表达,影响血管生成和血管渗透性,从而抑制腹水的形成,延长生存时间。