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华贵栉孔扇贝是我国南方沿海的重要海水养殖贝类之一,具有重要的经济价值。这种扇贝不但贝壳具有橙色、橙紫色、紫色、褐色等多种绚丽的色彩,而且闭壳肌、外套膜等肌肉也有橙色与白色之分。我们的前期研究发现,橙色个体(贝壳、外套膜、闭壳肌都是橙色)各组织中的类胡萝卜素含量均显著高于褐色个体(贝壳褐色、外套膜与闭壳肌均为白色),并且前者比后者具有更高的抗氧化能力。 在生物系统进化过程中,动物细胞为了保护自身免受损伤,形成了一套由抗氧化酶体系(如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化氢酶GPX等)和抗氧化非酶体系(如类胡萝卜素、辅酶Q、硒、维生素、含巯基化合物等)组成的抗氧化防御体系,以维持体内ROS的动态平衡,起到抗氧化的作用。SOD在清除活性氧反应过程中第一个发挥作用,它将超氧阴离子自由基快速歧化为过氧化氢和分子氧;过氧化氢在CAT和GPX的作用下转化为水和分子氧。因此,本文选CuZnSOD、MnSOD、CAT作为抗氧化的研究对象。 本文以课题组建立的华贵栉孔扇贝橙色品系和褐色品系为材料,采用36h的急性低温胁迫后,获得二者的外套膜、鳃、卵巢、血液等组织样品。然后克隆了CnCuZnSOD、CnMnSOD、CnCAT等三个基因的全长cDNA,并进行了同源性分析、时空表达分析,测定和比较胁迫组与对照组样品的总类胡萝卜素含量(TotalCarotenoidsContent,TCC)以及抗氧化相关酶活性等指标,从分子水平上探讨急性低温胁迫下橙、褐色两个品系中类胡萝卜素含量与其抗氧化防御之间的相关性。主要结果如下: 1、三个抗氧化基因全长cDNA序列的克隆。首先从本课题组454测序数据库中获得CnCuZnSOD、CnMnSOD以及CnCAT基因的部分cDNA序列,然后利用RACE-PCR以及通过序列拼接获得它们的全长cDNA。CnCuZnSOD基因为1078bp,共编码154个氨基酸残基;CnMnSOD基因全长序为1047bp,共编码226个氨基酸残基;CnCAT基因为1851bp,共编码522个氨基酸残基。同源分析发现,这三个基因与栉孔扇贝(Chlamysfarreri)、虾夷扇贝(Mizuhopectenyessoensis)以及海湾扇贝(Argopectenirradians)显示出更近的亲缘关系,它们先汇成一支后,之后依次与其它海洋贝类、昆虫、虾、蟹等节肢动物聚类,最后与脊椎动物聚类。 2、比较了三个基因在橙、褐色两个品系间的时空表达。采用real-timePCR方法对橙色与褐色品系各组织中CnCuZnSOD、CnMnSOD以及CnCATmRNA绝对含量及对急性低温胁迫下各组织中三个基因相对含量进行检测。三个抗氧化基因均在鳃中表达水平最高,而在别的组织间表达水平就有所差异。急性低温胁迫下,三个基因的表达量在橙、褐色两个品系扇贝的血液、鳃和外套膜上均出现了一种先升后降然后再升最后降至最低的变化趋势,并且多数情况下在橙色品系组织中的表达量高于褐色品系组织的表达量。 3、急性低温胁迫下,TCC、SOD和CAT酶活性的变化情况。急性低温胁迫下,橙色品系TCC显著高于褐色品系,也诱发SOD、CAT酶活性发生显著变化。本研究显示,在急性低温胁迫下,SOD活性表现为先降后升再降的变化趋势,橙、褐色两个品系的CAT比活力均经历了先大幅度地增高然后下降的变化,而且多数情况下橙色品系比褐色品系具有更高的SOD与CAT酶活力含量。 4、抗氧化基因表达量、类胡萝卜素含量和抗氧化相关酶活力之间的关系。在华贵栉孔扇贝橙色品系各组织中,CnCuZnSOD和CnMnSOD基因表达水平、TCC和SOD两两之间均存在显著的正相关(P<0.05),CnCAT表达水平、TCC以及CAT两两之间也存在显著的正相关(P<0.05);而在褐色品系中只有鳃组织中的CnCAT表达水平与CAT存在显著的正相关(P<0.05)。 本研究首次获得华贵栉孔扇贝三个抗氧化相关基因全长cDNA序列,并利用富含类胡萝卜素的品系首次系统地开展贝类低温生物学理论研究,给低温环境下抗氧化机制的研究提供了新角度。本研究丰富贝类抗氧化防御的研究理论,既可弥补养殖贝类低温生物学研究之不足,也可为耐低温新品种的培育提供理论依据。