本研究拟利用中间载体pGEMEX-Ⅰ将人乳铁蛋白(hLF)cDNA片断两端引入Xho Ⅰ的同尾酶Sal Ⅰ的酶切位点。用Sal Ⅰ酶切构建好的中间载体pGEMEX-Ⅰ-hLF，用Xho Ⅰ酶切乳腺特异性表达载体pBC1，然后将二者连接，构建hLF乳腺特异性表达载体pBC1-hLF，为下一步的细胞表达、动物实验和最终的乳腺生物反应器的构建奠定基础。 中间载体因为是常见大小的片断，又是定向克隆，很容易构建，但是在表达载体的构建过程中，存在几方面的问题：(1)表达载体很大，达21kb，转化效率会受到影响；(2)目的片断只有2kb，同载体大小相差较大，所以连接上会有一定困难；(3)只有一个外源基因插入位点Xho Ⅰ，不能利用定向克隆。这些因素将给实验造成相当的困难。 为了解决实验中遇到的问题，根据实验室的条件，先后进行了以下方面的试验：(1)利用本室条件对感受态的制作进行了优化；(2)对酶切后核酸片断的回收做了改进，保证体系中的核酸浓度；(3)对连接体系作了优化，先后试验了几种方案、不同核酸浓度，并利用电泳的方法对各种连接后的产物作了鉴定；(4)为避免出现筛选大量克隆的情况，利用CIAP对载体片断去磷酸化，为避免处理过度，对ClAP去磷酸化的效果作了分析，选用有效去磷酸化的较短时间；(5)对连接的温度作了试验。 结果发现，(1)连接体系中核酸浓度对结果影响较大，在本室条件下，连接体系中核酸浓度高于10ng／μl，载体：目的片断摩尔比1：3可获得不错的结果；(2)连接体系中核酸纯度对实验结果也有不小的影响；(3)连接体系中的PEG8000等成分虽然理论上可以增加分子问连接的几率，但是如果在转化前没有将其很好的去除，会对转化造成一定影响。其中最为关键的是核酸的浓度与纯度，对实验结果影响最大。当对核酸纯度和浓度作了调整后，去除连接体系中的PEG8000，最后得到了目的片断成功插入的克隆。 通过以上工作，对在本室条件下利用pBC1进行乳腺特异性表达载体构建的条件进行了探索，为下一步乳腺生物反应器方面工作的顺利开展打下基础。