透明质酸(hyaluronic acid, HA),又名玻璃酸,是由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖双糖重复单位通过p-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支的糖胺聚糖,广泛存在于动物组织的细胞间质和某些细菌的夹膜中。其相对分子质量(Mr)一般为1×105～1×107D,分子中两种单糖的摩尔比为1：1。HA常用的制备方法有动物组织提取法和细菌发酵法。由于HA具有良好的保湿作用、营养作用、皮肤损伤的修复和预防作用、增稠性等,其在化妆品领域的应用也日益广泛。商品HA一般为其钠盐,即透明质酸钠(Sodium Hyaluronate, SH)本课题重点研究了化妆品用透明质酸钠的理化、卫生质量标准及相关检验方法。1、外观性状目测观察SH样品应为白色或类白色颗粒或粉末。2、鉴别1)SH样品供试片的红外光吸收图谱(4000cm-1～400cm-1)应与SH红外光吸收对照图谱(《红外光谱集》第四卷1173图)一致,即在3400cm-1、1610cm-11400cm-1、1040cm-1附近有特征吸收。2)SH供试液显钠盐的火焰鉴别反应,在无色火焰上燃烧应显鲜黄色。3、pH值为6.0-8.0。用pH计测定1mg/ml的SH供试液,其pH值应为6.0-8.0。4、溶液的透光率(0.5%,A550nm)≥99.0%以纯化水作空白,在550nm波长处测定5mg/mlSH(?)容液的透光率应≥99.0%。5、干燥失重≤10.0%本研究对5批SH样品用烘箱干燥法测得干燥失重为：6.40、6.44、6.35、6.23、6.30；恒温减压干燥法测得为：6.38、6.43、6.30、6.17、6.22；卤素水分测定仪测得为：6.42、6.48、6.31、6.19、6.26。三种方法得出的结果基本一致,但前两种方法所需的时间较长,用卤素水分测定仪在110℃、15分钟即可完成干燥失重测定。6、平均相对分子量本研究对5批SH样品用多点法测得的特性粘度[η]分别为：27.32、24.64、22.56、16.18、13.42：用一点法测定[η]分别为：27.54、22.57、23.62、16.85、14.27。点法与多点法所测得SH的[η]非常接近,在保证T0大于100s,且T1/T0=1.30-1.50时,可用一点法代替多点法测定SH的[η]。再由公式计算SH平均相对分子量。7、透明质酸钠含量(以干品计)≥92.0%本研究以Bitter和Muir改良的咔唑法首先测定SH样品的葡萄糖醛酸的含量,再乘以2.0675(401.3/194.1=2.0675),即得。并进行了含量测定方法验证。准确度试验：采用标准加入法测定对照品的平均回收率为98.7%(回收率要求为98.0-102.0%),符合验证要求。精密度试验：采用重复测定6份供试品含量结果的相对标准偏差来表示,测定结果的相对标准偏差为1.15%,符合相对标准偏差不得大于2.0%的验证要求。线性和范围试验：方法适用范围为葡萄糖醛酸的浓度为0-50μg/ml；在此范围内,以葡萄糖醛酸浓度和吸光度计算回归方程,相关系数为0.9998,符合相关系数不得小于0.990的要求。耐用性试验：本研究主要考察反应时间对测定结果的影响。经试验,第一步水解加热时间大于8分钟后测定结果恒定,为保证水解反应,最终确定第一步水解加热时间为10分钟；第二步显色反应水浴加热时间为15分钟,在试验中应严格控制。专属性：本法适用于含葡萄糖醛酸分子在酸性条件下水解的多糖类化合物,专属性不强。但欧洲药典和国家药品标准中均用该法作为含量测定的法定方法。8、蛋白质含量(以干品计)≤0.1%本研究对5批SH样品用Folin-酚法测得的蛋白质含量(%)为：0.17、0.21、0.18、0.23、0.19；考马斯亮蓝法测得的蛋白质含量(%)为：0.0095、0.014、0.021、0.017、0.030。前者测定结果明显高于后者。考马斯亮蓝法灵敏度高,更适用于蛋白质为少量成分的SH样品。9、重金属含量(以Pb计)≤20ppm本研究将1.0g SH经过一系列化学处理后制成25ml供试液；同时制备25ml含标准铅20ppm的对照液。在对照液管和供试液管中分别加入硫代乙酰胺试液2ml,显色后,供试液管显出的颜色不得更深于标准对照管。10、细菌数≤100cfu/g；霉菌及酵母菌数≤50cfu/g；每克供试品中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粪大肠菌群均不得检出。本研究用营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基分别测定SH的细菌数、霉菌及酵母菌数。同时,用营养肉汤增菌后划线接种于甘露醇氯化钠琼脂的平板上以及血浆凝固酶试验来检测金黄色葡萄球菌。另外,用胆盐乳糖增菌后划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂的平板上以及氧化酶试验、绿脓菌素试验来检测铜绿假单胞菌；用双倍乳糖胆盐培养基在44℃～45℃培养是否产酸产气、伊红美蓝琼脂平板及靛基质试验来检测粪大肠菌群。