稳定支持小反刍兽疫病毒增殖的永生化羊源细胞系构建及鉴定

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:any_ray
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小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)作为副黏病毒科麻疹病毒属的一个重要组成成员,在临床上能够引起野生和家养小反刍动物发病,以高热,肺炎,腹泻和呼吸道黏膜炎症为主要特征。PPRV属于有囊膜的单股负链RNA病毒,基因组大小为15948nt,编码8个蛋白(N,P,C,V,M,F,HN和L)。动物细胞系是病毒基础研究和应用的主要平台之一。然而,有许多病毒因缺乏能支持其稳定增殖的细胞系,例如PPRV和RHDV等。而导致其相关基础和应用研究工作进展十分缓慢。为解决该技术瓶颈,原代细胞的永生化技术应运而生。本研究旨在构建一株能稳定支持PPRV增殖的羊源永生化细胞系。首先,构建了pLOV-puro-hTERT重组质粒,然后利用慢病毒包装系统,从293T细胞中拯救出重组慢病毒并感染原代绵羊肺成纤维细胞,在感染48h后,用嘌呤霉素连续加压,筛选出具有抗性的存活细胞,将其扩增并连续传代至第10代,分别用分子生物学和年医学方法鉴定以后,最终获得了永生化原代绵羊肺成纤维细胞系,并将其命名为SLT细胞系。遗憾的是,RT-PCR和WB结果显示SLT细胞系可以支持PPRV的增殖,但是并没有出现PPRV典型的细胞病变并且PPRV在SLT细胞上传至第五代后也检测不到PPRV的存在,同时表明SLT细胞系不能稳定支持PPRV的增殖。有研究表明山羊信号淋巴激活分子(Goat Signaling Lymphocyte Activation Molecule,gSLAM)是PPRV感染易感宿主细胞的一个重要的细胞受体之一。为了增加永生化细胞系(SLT细胞)对PPRV的敏感性,我们利用慢病毒包装系统又构建了稳能定表达gSLAM的绵羊肺成纤维细胞系,命名为SLT-gSLAM细胞系。最后,PPRV-Nigeria/75株接种SLT-gSLAM细胞,连续传代3次后,发现细胞产生典型的合胞体现象,并且可连续传至10代。RT-PCR和WB方法的检测结果均显示:SLT-gSLAM细胞系可以稳定地支持PPRV的增殖,并且病毒在感染细胞后48h,滴度可以达到105.6。综上所述,本研究成功构建了一株可以稳定支持PPRV体外增殖的羊源细胞系,为深入研究PPRV的分子致病机制提供了一个良好的操作平台。
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