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哈维氏弧菌(Vbrio harveyi)是水产养殖业中一种常见的条件致病菌,可导致多种水产养殖品种大量死亡,造成巨大的经济损失。传统的富集培养以及分子生物学检测方法操作复杂且检测时间较长,无法应用于基层单位现场检测。因此,迫切需要建立一种快速、简单的方法对V.harveyi进行监测,以便在病害暴发早期采取有效措施,减少经济损失。本课题基于单克隆抗体制备技术,开发一种快速检测V.harveyi的方法。首先,以甲醛灭活的V.harveyi作为免疫原制备用于检测的单克隆抗体。分别采用PEG融合和电融合两种方法进行细胞融合。经筛选及亚克隆后,成功获得两株可特异性分泌抗V.harveyi单克隆抗体的杂交瘤细胞4D9和2B9。将筛选获得的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱导腹水的产生,以蛋白G纯化腹水获得单克隆抗体,经亚型鉴定两种抗体均为IgG1。其次,制备25 nm胶体金颗粒用于纯化的单克隆抗体标记。最后,进行两种抗V.harveyi单克隆抗体的配对试验并进行免疫层析试纸条的制备。由于两种单抗亚型相同,很可能针对相同抗原决定簇,不能同时应用于夹心法制备试纸条。因此,改用一种单克隆抗体与V.hareyi多克隆抗体配合制备免疫层析试纸条。该试纸条虽然可检出108 CFU/ml的V.harveyi,但由于存在假阳性,并不能应用于实际检测。由于制备免疫层析试纸条的结果不理想,我们基于传统斑点杂交实验方法进行了优化和改进。为提高斑点杂交法对V.harveyi的检测灵敏度,以化学发光底物(ECL)代替TMB底物用于显色,并对斑点杂交法封闭试剂、斑点杂交用膜种类以及封闭时间进行优化。结果表明,与传统斑点杂交法相比,ECL介导的斑点杂交法反应时间大幅度缩短,孵育时间由8 h缩短至2 h。对V.harvey 纯培养物的最低检测限达到2×105 CFU/ml,较传统斑点杂交法(1×107CFU/ml)灵敏度提高了 50倍。与间接ELISA相比,该方法的检测灵敏度提高了近1000倍(CFU/CFU)。在检验人工接种V.harveyi的组织匀浆样本时,ECL介导斑点杂交法并未受到复杂背景的影响,预孵育6 h后最低检测限可达到10 CFU/ml,操作过程简单,可以应用于基层养殖单位。