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T10c12-CLA(trans 10,cis 12-conjugated linoleic acid)是自然界中存在的亚油酸异构体之一,主要用于降低身体脂肪含量、预防心血管疾病和肿瘤发生。有研究认为t10c12-CLA对于减肥没有显著影响,反而会增加糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管疾病的发病率。问题是大部分基础研究使用了过量的t10c12-CLA或非t10c12-CLA纯品的工业制剂。动物和临床实验中,日粮的脂肪含量难以控制,另外实验动物和志愿者的个体差异、年龄、性别和营养状态都会影响实验结果,所以很难对t10c12-CLA的矛盾结果作出解释。本文拟以亚油酸异构酶PAI为材料,通过实验一饲喂小鼠产t10c12-CLA的重组乳酸球菌实验,和实验二监测pai转基因小鼠的生理参数变化,来详细探讨t10c12-CLA的生物活性及其对哺乳动物健康的影响。实验一中,用pai基因转化获得了产t10c12-CLA的食品级重组乳酸球菌,将其拌入不同脂肪含量的饲料中进行三组昆明白小鼠的饲喂实验。分别为10%正常脂肪含量的常规饲料饲喂正常小鼠(Slim组),45%高脂饲料饲喂正在诱导肥胖(DIO-inducing组)和已经肥胖(DIO组)的小鼠。每组分别与饲喂不产t10c12-CLA的对照菌株的小鼠进行比较,实验组小鼠主要生长和生理参数变化如下:Slim组中,饲喂乳酸菌1个月后体重增长率显著降低(P<0.05);腹部脂肪的相对质量显著减少(P<0.05);褐色脂肪相对质量显著增大(P<0.05);肝脏细胞中存在早期脂肪变性;总胆固醇和LDL-C的浓度、TC/HDL和LDL/HDL的比值显著降低(P<0.05)。DIO-inducing组中,在添加乳酸菌10天后,实验组小鼠的体重增长率显著增加(P<0.05);腹部脂肪相对质量显著增大(P<0.05);肝脏细胞出现中度的水肿性变性;甘油三酯含量和TG/HDLL比值显著增加(P<0.05)。DIO组中,实验组体重增长率和对照组没有显著差异;但肝脏细胞出现严重的脂肪变性;LDL含量、LDL/HDL和TC/HDL的比值显著降低(P<0.05)。另外,用气相色谱分析发现,三组小鼠中心、肝、脾、肾等组织器官中各种脂肪酸含量也有不同种类和不同程度的变化。实验二中,先用经过密码子优化的pai基因构建到细胞表达载体上(pIRES2-AcGFP1-pai),脂质体转染NIH/3T3细胞,通过G418筛选,GFP荧光检测和RT-PCR分析,挑选了三株能够稳定表达pai的细胞株,对其脂肪酸组分进行了气相色谱分析。结果显示,与PAI阴性细胞组相比,t10c12-CLA的含量升高了 223.7%(P<0.05),并抑制了细胞内delta-6脱氢酶的活性使ARA的含量显著降低(P<0.05)。这说明密码子优化的pai能够在哺乳动物细胞内有效地表达,为研制转基因动物提供了有力依据。随后,构建了 pCAGGS-pai表达载体,通过原核显微注射的方法生产转基因小鼠。利用基因组PCR和Southern blot鉴定方法,获得了四只转基因小鼠,通过RT-qPCR分析获得了 1只高表达pai基因的家系,且在心、肝、脾、肾、卵巢、睾丸和肌肉组织中都有表达。对转基因家系体重进行分析发现,3周龄转基因雌鼠体重显著低于野生型(P<0.05);分别进行正常和高脂饲料饲喂1个月后,LDL/HDLL比值显著降低(P<0.05);在肝、肾和肌肉组织中能检测到微量的t10c12-CLA;饲喂正常饲料的转基因小鼠心脏组织和肌肉组织的delta-6脱氢酶活性受到抑制。饲喂高脂饲料使转基因小鼠的腹部脂肪相对质量显著降低。这些结果说明,pai在哺乳动物中能够成功表达并能影响体内脂肪酸代谢相关的酶类,还能够降低低密度脂蛋白与高密度脂蛋白的比值,这对动物减肥和降低心血管疾病的发生具有积极作用。两个实验结果表明,t10c12-CLA对哺乳动物健康的影响受日粮中脂肪含量和动物自身肥胖程度的共同影响。