猪圆环病毒数字PCR检测技术的建立

来源 :中国计量大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fengliguo1
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进出境检验检疫作为进出境动植物检验场所,需要高效而快速的检测手段。猪圆环病毒作为二类传染疫病,主要分为猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型,在全世界的养猪场里广泛传播。需要对进出境种猪、猪肉产品、含猪肉成分产品进行检验检疫,预防疫病的传播。本研究建立两种新型、灵敏并且操作简单的猪圆环病毒数字PCR单重以及三重检测方法。单重微滴式数字PCR已成功的应用到了饲料样品、猪组织中PCV 2病毒含量的情况检测。三重芯片式微滴数字PCR已经建立了完善的试验体系来证明该法的有效性及灵敏度。两种检测方法都与Taq Man实时荧光定量PCR方法进行验证比较,确定这两种数字PCR都是能够达到出入境检验检疫中检疫猪圆环病毒高效灵敏的方法。本研究主要内容及结果如下:1.PCV 2 dd PCR检测方法的建立以PCV 2基因序列(MG245866)基础,设计特异性探针及一对引物,在进行dd PCR退火温度和探针引物终浓度优化后,建立了PCV 2的dd PCR方法以及q PCR方法。两种方法的线性关系表明dd PCR在1.37×10~5拷贝/μL~1.37拷贝/μL具有良好的线性关系,q PCR在1.37×10~6拷贝/μL~1.37×10~1拷贝/μL具有良好的线性关系。当重组质粒稀释到10~8倍数量级以下时,dd PCR可以检测到阳性微滴,但q PCR已无明显的扩增曲线,dd PCR其最低检测限为2.93拷贝/μL.敏感性比q PCR高10倍。将建立好的dd PCR方法应用到对CSFV、ASFV、PCV1、PCV 3、PRRSV和PRV的核酸检测中,它们的结果均呈阴性,证明实验结果具有可靠性。无论是组间重复性试验还是组内重复性试验,两者的变异系数均小于10%,表明建立的dd PCR检测PCV 2方法稳定性高和重复性好。进一步对24份猪组织样品和70份宠物饲料实际样品的检测结果显示,q PCR和dd PCR对于猪组织样品的检测结果一致。然而dd PCR对饲料样品的检测更为灵敏,检出了5份q PCR为假阴性的饲料样品,体现了dd PCR对于复杂基质样品的强大适应性。2.三重Crystal数字PCR检测PCV方法的建立根据PCV 1基因序列(KC447455.1)、PCV 2基因序列(MG245866)和PCV3基因序列(NC_031753.1)为模板,分别设计对应的特异性引物及探针,在进行PCR退火温度优化、q PCR引物终浓度优化以及三重Crystal数字PCR探针终浓度优化反应后,建立了三重Crystal数字PCR检测PCV 1、PCV 2、PCV 3的方法。同时也通过q PCR方法来进行比较。建立的标准曲线结果显示,三重Crystal数字PCR在检测PCV 1、PCV 2、PCV 3均具有良好的线性关系,它们的相关系数分别为:R~2PCV1=0.9878、R~2PCV2=0.9966、R~2PCV3=0.9833,扩增效率分别为:EPCV1=90%、EPCV2=98%、EPCV3=94%,表明其具有良好的扩增效率和相关性;该法的特异性良好,只能特异性扩增相关基因,建立的三重Crystal数字PCR最低能够检测到质粒标准品的拷贝数为PCV 1:4.96拷贝/μL、PCV 2:12.29拷贝/μL、PCV 3:11.54拷贝/μL。抗干扰试验表明该法的最低检测限不受到相似病毒的影响。且重复性试验表明,组内重复性变异系数均在10%内,组间变异系数在10~6拷贝/μL~10~1拷贝/μL数量级时变异系数良好,在10~0拷贝/μL数量级时较为一般,但均能检出。说明建立的三重Crystal d PCR具有良好的重复性,具有市场应用潜力。
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