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双子叶植物花发育的研究已取得了重大的进展,但单子叶植物花发育的研究还相对滞后。本实验室在水稻辐射诱变后代中发现了一种雌雄蕊完全退化的突变体psd2(pistil-stamen degeneration)。通过精细定位,将PSD2基因定位于两个微卫星标记SSR24和SSR29之间43.7kb的区域,并初步确定该区域内的两个磷酸酯酶基因TG1(triacylglycerol lipase)和TG2为PSD2的候选基因。在此基础上,本研究对PSD2侯选基因的表达和功能进行了分析,主要研究结果如下:
1、分别用TG1和TG2的互补载体转化水稻,得到10株TG1转化正常基因型的植株,3株TG2转化正常基因型的植株,但未得到互补载体转化突变体的植株。同时还用这两个互补载体同时转化水稻,检测到一株转入双互补载体的转基因植株。目前这些转基因植株在大田生长,尚未抽穗,无法观察其花器官的表型变化。利用35S::TG1表达载体转化水稻,得到转基因植株16株。半定量RT-PCR分析结果表明,这些过量表达植株中TG1基因的表达水平明显增强,但它们的营养生长和花器官发育均正常,与野生型植株无明显差异。
2、构建了候选基因TG2的GUS表达载体pTG2::GUS并进行遗传转化。利用PCR的方法扩增出1228bp的TG2启动子序列,用SacⅠ和SmaⅠ酶切后连接到pCAMBIA13912载体上,得到pTG2::GUS表达载体。用该载体转化水稻,已获得12个转基因植株,目前已移入大田种植,尚未开花,未能做GUS组织染色。
3、利用半定量RT-PCR分析了PSD2的两个候选基因在水稻不同部位的表达水平。结果表明,TG1基因的表达明显比TG2基因强。TG1基因在0.5-1cm的幼穗和根中的表达很强,而在1-5cm的幼穗和叶片中则明显降低。TG2基因在水稻的不同组织中表达均很低。其中,在0.5-1cm的花序中表达相对较高,而在1-5cm幼穗、叶片和根中的表达相对较低。
4、利用半定量RT-PCR分析了水稻花器官发育特征基因在野生型和psd2突变体幼穗(0.5-1cm)中的表达水平的变化。结果表明,突变体中只有1个A类基因(OsMADS15)表达上调;有5个基因的表达明显下调,包括2个B类基因(OsMADS4/16)、2个C类基因(OsMADS3/58)和1个E类基因(OsMADS7);而其它花器官发育特征基因则无明显变化。这些基因表达水平的变化与psd2突变体表型的变化基本一致。