目的本研究以自发性肥胖型2型糖尿病db/db小鼠为研究对象,观察红芪多糖(HPS)对糖尿病心肌病(DCM)心肌的保护作用,借助PCR Array筛选模型动物心肌纤维化的相关基因,寻找控制氧化应激和炎症反应的重要基因和途径,验证模型动物DCM发病过程中心肌组织PPARγ/NF-κB信号通路及其下游相关基因的表达及HPS干预的影响,探讨HPS干预DCM心肌纤维化的作用机理,揭示具有补气化瘀功效的红芪之有效成分HPS治疗糖尿病及其慢性并发症“虚、瘀、毒”病机理论的科学内涵,为HPS防治DCM提供科学依据。方法:本研究分为以下三部分内容(1)第一部分:6周龄雄性2型糖尿病db/db小鼠60只,随机分为HPS高、中、低剂量组、罗格列酮组和模型组5组;同周龄同品系非糖尿病db/m小鼠12只作为正常组。灌胃给药8周后,心脏取血,颈椎脱臼处死后取出心脏。全自动生化分析仪检测血清LDH、CK-MB、TC、TG的含量;ELISA法测定心肌中羟脯氨酸(Hyp)含量;HE、Masson染色观察小鼠心肌组织病理学改变及纤维化程度,透射电镜观察小鼠心肌组织超微结构;q PCR和Western blot法检测心肌Collagen I和Collagen III m RNA和蛋白的表达;做Collagen I、Collagen III的蛋白表达与Masson染色胶原纤维阳性染色面积值的相关研究。(2)第二部分:6周龄db/db小鼠3只作为模型组,db/m小鼠3只作为正常组,喂养8周后处死取出心脏,采用PCR Array筛选糖尿病db/db小鼠与非糖尿病db/m小鼠心肌组织之间差异表达的基因,探讨DCM心肌纤维化的发病机理及寻找PPARγ控制氧化应激和炎症反应信号通路中的关键基因,为下一步深入研究HPS防治DCM心肌纤维化提供更精准的作用靶点和调控机制。(3)第三部分:实验动物及分组灌胃给药同第一部分,于干预第8周末处死取出心脏。检测心肌组织中SOD和GSH-PX的活性、MDA的含量以及心肌组织TNF-α和IL-6的含量;q PCR和Western blot检测心肌PPARγ、NF-κB、GLUT-4、IKKβ、MMP-2、MMP-9 m RNA和蛋白的表达,分析各个指标与心肌纤维化的相关性以及PPARγ/NF-κB信号通路与氧化应激和炎症反应的相关性。(1)(1)HPS高、中剂量组及罗格列酮组血糖在第2、4、6、8周均明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)。与正常组比较,模型组TG、TC、LDH、CK-MB水平均明显升高(P<0.01),HPS高、中剂量组和罗格列酮组小鼠血清TG、TC、LDH、CK-MB水平较模型组明显降低(P<0.01),尤其在降低血清TC、LDH和CKMB方面,HPS高剂量组最为显著(P<0.05或P<0.01)。(2)模型组心肌组织Hyp含量明显高于正常组(P<0.01),各干预组Hyp含量均明显降低(P<0.01),尤其以HPS高剂量组最明显。(3)光镜下HE和Masson染色可见模型组小鼠心肌细胞肥大、结构模糊、排列紊乱,边界不清,伴有大量心肌成纤维细胞增生,细胞核出现固缩,有的裂解丢失,肌纤维断裂、分离,细胞间质见炎性细胞浸润;Masson染色见模型组小鼠心肌间质亮绿色胶原纤维及半定量分析胶原纤维阳性染色面积比值都较正常组明显增多(P<0.01),而各干预组小鼠心肌病理损害得到明显改善、心肌胶原纤维阳性染色面积明显减少(P<0.01),尤其以HPS高剂量组最明显。(4)电镜结果显示:模型组心肌细胞肌纤维稀疏、扭曲,肌丝溶解断裂,明带和暗带紊乱,细胞核浓缩;线粒体肿胀变性,嵴减少且大部分融合、断裂,可见糖原颗粒和脂滴沉积;而HPS高剂量组和罗格列酮组心肌超微结构损伤较模型组明显减轻。(5)q PCR和Western Blot结果显示:与正常组比较,模型组心肌中Collagen I和Collagen III m RNA和蛋白表达水平明显增加(P<0.01),I/III型胶原蛋白比值升高;8周后,各干预组Collagen I和Collagen III m RNA和蛋白表达水平较模型组明显降低(P<0.01),I/III型胶原蛋白比值也明显降低。(6)心肌组织中Collagen I、Collagen III的蛋白表达与Masson染色胶原纤维阳性染色面积比值均呈正相关(P<0.01)。(2)与正常组比较,模型组84个基因中有64个基因出现差异,其中上调61个基因,下调3个基因。差异表达基因分类如下:(1)与糖尿病发生发展有关的受体、转运和通道基因表达上调17个,下调了1个Slc2a4(Glut4);转录因子类基因表达上调11个,如Nfkb1、Nrf1等;信号转导类基因表达上调9个:如Ikbkb(IKKβ)、Irs1、Irs2、Mapk14(p38alpha)等,核受体基因PPARα和PPARγ表现为下调;(2)PPARγ靶标基因:脂肪生成类Adipoq表达上调,脂肪酸代谢类上调10个基因,如Acsl3、Acsl4等。(3)PPAR通路上调了Acsl3、Acsl4等5个基因,其中Acsl3、Acsl4两个基因同时存在于脂肪酸代谢类中。(4)氧化应激类的靶基因上调6个,如Gclc、Gsr、Hmox1、Nqo1等;(5)转化生长因子-β的靶基因上调了4个。结果(3)(1)与正常组比较,模型组小鼠心肌组织中SOD、GSH-PX活性降低(P<0.01),MDA含量升高(P<0.01),IL-6、TNF-α的含量升高(P<0.01);与模型组比较,HPS高、中剂量组及罗格列酮组SOD、GSH-PX活性增强(P<0.01),MDA含量降低(P<0.01或P<0.05),IL-6、TNF-α的含量降低(P<0.01),其中HPS高剂量组与罗格列酮组疗效相当。(2)与正常组比较,模型组心肌组织中PPARγ、GLUT-4、MMP-2 m RNA和蛋白表达量明显降低(P<0.01),NF-κB、IKKβ、MMP9 m RNA和蛋白表达量明显升高(P<0.01),与模型组比较,HPS高、中剂量组和罗格列酮组心肌组织中PPARγ、GLUT-4、MMP2 m RNA和蛋白的表达均明显升高(P<0.01),NF-κB、IKKβ、MMP9 m RNA和蛋白的表达明显降低(P<0.01),且HPS高剂量组作用相对优于罗格列酮组(P<0.01)。(3)心肌组织中Hyp含量与TNF-α、IL-6、MDA的水平呈正相关(P<0.01),与SOD、GSH-PX的水平呈负相关(P<0.01);心肌组织胶原纤维阳性染色面积与PPARγ蛋白表达呈负相关(P<0.01),与NF-κB蛋白表达呈正相关,(P<0.01);PPARγ蛋白表达水平与SOD、GSH-PX水平呈正相关,(P<0.01),与MDA水平呈负相关,(P<0.01);NF-κB蛋白表达与IL-6、TNF-α含量均呈正相关,(P<0.01)。结论1.HPS能减轻模型动物DCM心肌细胞和组织的损伤,减轻心肌胶原沉积和间质纤维化,其作用机制可能与抑制心肌组织中Collagen I和Collagen III的表达有关。2.通过本研究设计定制的PCR Array芯片筛选,初步发现了PPARγ/NF-κB及所调控的下游炎症反应、氧化应激、脂肪酸代谢等64个表型基因参与了糖尿病心肌病db/db小鼠心肌纤维化的病理过程。3.HPS可显著减轻模型动物DCM心肌组织的炎症反应,改善心肌氧化应激状态,其作用机制可能与调控PPARγ/NF-κB信号通路及下游相关细胞因子有关。4.血糖、血脂、Collagen I、Collagen III、TNF-α、IL-6、MDA、NF-κB、IKKβ、MMP9的表达增强是加快模型动物DCM心肌细胞和组织损伤、心肌组织炎症反应、氧化应激以及心肌胶原沉积和间质纤维化的病理基础,是糖尿病及慢性并发症“瘀、毒”的分子学基础,而PPARγ、GLUT-4、SOD、GSH-PX等是糖尿病及慢性并发症“虚”的分子学基础,具有补气化瘀功效红芪有效成分HPS能够对上述因子在DCM小鼠心肌组织中的表达不平衡起到一定的调节作用,使其表达趋于平衡,这可能是其抑制心肌纤维化进程的有效机制之一。