研究背景百日咳是全世界婴儿发病和死亡的重要原因,它是由百日咳鲍特菌引起的、主要通过飞沫传播的一种急性呼吸道传染病,传染性极强,可感染任何年龄的人,但婴幼儿更敏感。1974年世界卫生组织开始实施扩大免疫规划,此后百日咳发病数和儿童死亡人数急剧减少,但近年来,某些疫苗覆盖率较高的发达国家如英国、美国、澳大利亚、荷兰等相继报道百日咳发病率在保持多年低水平以后再次升高,调查分析认为,一个重要原因就是无症状的百日咳传播,携带百日咳鲍特菌的无症状感染者传播给易感个体,引起其发病或死亡,但百日咳鲍特菌携带者在人群中的携带率和流行病学特征尚不清楚,这主要是由于感染者的临床症状严重程度与细菌载量成正相关,无症状携带者的细菌载量较低而不表现临床症状,在临床中不易被发现。另外目前的实验室检测方法无法满足低载量检测和定量细菌载量这两个要求。作为第三代PCR技术的微滴式数字PCR技术,能够不依靠标准曲线及外参标准品,通过直接计数或利用泊松定律获得目的基因的拷贝数,实现真正的绝对定量,其重复性、准确性和灵敏度具有无可替代的优势,尤其适合低载量病原体的定量。因此,本研究主要目的就是建立基于微滴式数字PCR技术的、适合于检测健康人群中百日咳鲍特菌的绝对定量方法。研究目的1系统地建立一种基于微滴式数字PCR技术的百日咳鲍特菌检测方法,并评价其特异性、灵敏性、重复性和准确性。2比较本研究建立的微滴式数字PCR方法与传统的细菌培养法、荧光定量PCR方法对百日咳鲍特菌的定量研究结果。3探讨微滴式数字PCR方法在健康人群和临床中检测百日咳鲍特菌的应用。研究方法1菌株和质粒百日咳鲍特菌参考菌株(ATCC9797)由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供;含百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis,Bp)的单拷贝基因IS481质粒参考品由北京擎科生物科技有限公司合成。2样本健康人群样本为2018年12月在云南省昭通市采集的无发热、咳嗽等症状村民的鼻咽拭子;临床样本为2018年8月-2019年3月在河北省儿童医院采集的疑似百日咳病例的口咽拭子。3实验方法3.1细菌培养方法2018年12月在中国疾病预防控制中心的云南省昭通市细菌性疾病监测点,选择无发热、咳嗽等症状的健康村民作为研究对象,研究对象入选标准如下:1近一月内无发热、咳嗽、咽痛等呼吸道症状2近一月内未用过抗生素及抗病毒药物3无其他急性、慢性呼吸道疾病采用分层随机抽样方法,分为7个年龄组(<1岁、1-2岁、3-5岁、6-17岁、18-24岁、25-54岁和≥55岁),每组采样对象30人。由同一受过专业培训的工作人员采集研究对象的两支鼻咽拭子。其中随机采集一侧鼻孔的一支鼻咽拭子在现场接种,将鼻咽拭子先在培养基一区(1/3大小)旋转涂抹,然后用三区划线法将接种环接种于选择性木炭琼脂培养基上(含10%羊血)。接种后的培养基,保温运送至实验室,置于纯氧培养箱,进行传统的分离培养法并应用革兰染色方法、qPCR方法和血清凝集实验进行鉴定。3.2 荧光定量PCR方法3.2.1 样本处理1 健康人群样本:上述在云南省昭通市采集健康人群的另一支鼻咽拭子,立即运送回实验室(4h内)。在含有600μl 0.85%生理盐水的Eppendorf管中反复捻动洗脱50-80次,保证拭子残留物充分洗脱至洗脱液中后,将洗脱液12,000rpm离心5min,去除上清,加入100μl去离子水于100℃金属浴中加热10min,将洗脱液12,000rpm离心5min,取上清液应用荧光定量PCR检测CT值,于-80℃中保存。2 疑似百日咳病例样本:样本为2018年8月-2019年3月在中国疾病预防控制中心细菌性疾病监测点一河北省儿童医院采集的疑似百日咳病例的口咽拭子,将口咽拭子在含有600μl 0.85%生理盐水的Eppendorf管中反复捻动洗脱50-80次,保证拭子残留物充分洗脱后,将洗脱液12,000rpm离心5min,去除上清,按照QIAamp DNA mini kit试剂盒说明书提取样品DNA,于-80℃中保存。3.2.2 样品检测应用qPCR检测3.2.1中健人群样本和疑似百日咳病例样本的CT值。以qPCR方法的检测下限作为健康人群无症状百日咳的判断标准,即样本CT值<38判断为阳性。以世界卫生组织推荐的CT<35作为疑似百日咳病例样本的阳性判断标准。3.3 基于微滴式数字PCR技术的百日咳鲍特菌检测方法3.3.1 建立方法通过优化退火温度、引物和探针浓度系统建立基于微滴式数字PCR技术(ddPCR)的百日咳鲍特菌检测方法。3.3.2评价方法应用我国临床常见呼吸道细菌的DNA评价该方法的特异性;应用10倍倍比稀释的单拷贝基因IS481质粒参考品来评价该方法的灵敏性和准确性;应用10倍倍比稀释的百日咳鲍特菌DNA来评价该方法的重复性。3.4 ddPCR方法与细菌培养方法、qPCR方法对百日咳鲍特菌定量的比较制备百日咳鲍特菌菌悬液UV600=0.5O.D,经逐级10倍稀释后,取100μl于木炭琼脂培养基连续培养,5d统计菌落数(CFU/μl);应用QIAamp DNA mini kit试剂盒提取百日咳鲍特菌菌悬液(UV600=0.5O.D)的DNA,DNA逐级10倍稀释后应用ddPCR与qPCR分别检测,比较三种方法对百日咳鲍特菌的定量结果。3.5 ddPCR方法在健康人群和临床中的应用分别应用ddPCR和qPCR方法检测健康人群鼻咽拭子样本和疑似百日咳病例的口咽拭子样本。4数据处理与统计学分析qPCR方法(CT值)和ddPCR方法(copies/μl)的检测结果,用平均数和标准差表示;组内重复性和组间重复性用变异系数CV表示;通过线性回归分析ddPCR结果与细菌培养结果的相关性、ddPCR结果的对数值与qPCR结果的相关性,并计算直线相关系数R2;qPCR方法和ddPCR方法的检出率一致性应用Cohen’s kappa系数表示,两种方法检出率之间的比较采用配对卡方检验。P<0.05为存在统计学差异。研究结果1 本研究建立了基于ddPCR技术的百日咳鲍特菌检测方法,其优化的退火温度为51.1℃,引物浓度为400nM,探探针浓度为200nM,并对其灵敏性、特异性、准确性和重复性进行评价。结果显示,对脑膜炎耐瑟菌(Nm)、肺炎链球菌(Sp)、流感嗜血杆菌(Hi)、支气管败血鲍特菌(Bb)以及去离子水(NTC)的检测结果均为阴性,无非特异性扩增;该ddPCR方法的检测最低下限为1 copy/反应;组内、组间重复性的CV分别为1.62%和0.89%;ddPCR检测范围为六个数量级,在质粒参考品4.0 copies/μl-4.0×104copies/μl浓度范围内,目的基因理论拷贝数与数字PCR检测出的拷贝数成直线线性相关且R2=0.9998。2在检测健康人群百日咳鲍特菌的应用中,依据ddPCR最低检测下限(1copy/反应)作为ddPCR检测无症状百日咳的判断标准:CT<35的4份样品、35≤CT<38的7份样品、38≤CT<40的7份样品全部检测出阳性液滴,≥40的20份样品中11份检测出阳性液滴,ddPCR方法的检出率达到76.32%(29/38);以qPCR方法的检测下限(CT值为38)作为qPCR检测无症状百日咳的判断标准,qPCR方法检测出的阳性率为28.95%(11/38),细菌培养方检测菌落数阳性结果为0。3在检测疑似百日咳临床病例的应用中,ddPCR结果为:CT<35的40份样品均检测出阳性液滴,35≤CT<38的26份样品中25份检测出阳性液滴,38≤CT<40的9份样品中8份检测出阳性液滴,CT≥40的12份样品中5份检测出阳性液滴。根据构建的qPCR标准曲线,估算出CT为35时对应29.4 copies/μl,当以CT<35和样本初始浓度>29.4 copies/μl分别作为qPCR和ddPCR方法诊断百日咳的标准,ddPCR方法阳性率为51.72%(45/87),而qPCR的阳性率为45.98%(40/87),两种方法的Cohen’s Kappa值为0.89,具有高强度的一致性,差异无统计学意义(P=0.063)。研究结论1系统建立了基于QX200微滴式数字PCR技术的百日咳鲍特菌的检测方法的特异性好、准确性好,比传统的细菌培养法、荧光定量PCR方法更灵敏。2微滴式数字PCR方法比细菌培养方法、荧光定量PCR方法更灵敏,更适合健康人群无症状百日咳的检测,为无症状百日咳检测提供了一种新方法。3微滴式数字PCR法在临床样本检测中与荧光定量PCR法有着高度一致性,但灵敏性更高,能够应用于百日咳鲍特菌的实验室诊断,提高检测率,发现更多的百日咳感染者。4可基于微滴式数字PCR技术建立其他呼吸道常见细菌例如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌等检测方法。