论文部分内容阅读
研究背景食管癌是常见的恶性肿瘤,预后较差,死亡率高。在我国,食管癌居各类恶性肿瘤第五位,也是癌症导致死亡的第四大原因,发病率为16.7/10万,死亡率为13.4/10万。虽然食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma,EAC)已成为欧美等国食管癌的主要病理组织学类型,但食管鳞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)仍是我国的主要类型。食管鳞癌发生发展的分子机制尚不完全清楚,值得注意的是,近年来的研究表明长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNA)可能与食管鳞癌的发病机制存在明显关联。Lnc RNA是一组长度超过200个核苷酸的非编码RNA,不编码蛋白,但能对细胞的生命活动起调控作用。目前国内外对食管鳞癌中lncRNA表达与功能的研究逐步增多,多项证据表明lncRNA在食管鳞癌发病中起重要作用。首先,在一些细胞研究中,部分lncRNA被报道为致癌基因或抑癌基因;其次,多种lncRNA的表达和调控模式也与食管鳞癌患者的治疗、临床分期、预后等临床参数有关。这些结果提示基于lncRNA的治疗策略在食管鳞癌治疗中具有很大的潜力。因此,深入研究lncRNA的功能有助于阐明食管鳞癌发生发展的分子机制,为临床上治疗食管鳞癌提供新的靶点,为食管鳞癌患者预后提供新的预测标志物。目的本研究分析lncRNA GAS8-AS1在食管鳞癌中的表达情况,探究GAS8-AS1对食管鳞癌的作用及其参与的分子机制,为临床诊断、治疗及预后评估提供可靠的理论基础和新的方向。方法首先,通过RNA-seq分析在食管鳞癌及其癌旁组织中差异表达的lncRNA,确认lncRNA GAS8-AS1在食管鳞癌中存在低表达,通过q PCR进一步扩大样本分析确认lncRNA GAS8-AS1在食管鳞癌和正常组织中的表达差异,并且分析lncRNA GAS8-AS1表达对临床上食管鳞癌患者生存的影响;其次,通过细胞生物学、分子生物学等实验分析lncRNA GAS8-AS1表达对食管鳞癌细胞存活、增殖、凋亡的影响;通过裸鼠皮下移植瘤模型探讨lncRNA GAS8-AS1表达对肿瘤形成的影响;最后,筛查和验证lncRNA GAS8-AS1的靶基因,检测靶基因的表达及参与的信号通路。结果1.LncRNA GAS8-AS1在食管鳞癌组织中的表达测序结果表明,与癌旁组织相比,食管鳞癌组织中有不同的基因表达上调和下调。其中,lncRNA GAS8-AS1在食管鳞癌组织中下调较为明显(p<0.05)。我们利用qPCR进行了进一步的确认,发现与癌旁组织相比,lncRNA GAS8-AS1在食管鳞癌组织中的表达的确出现下调(p<0.05)。此外,我们分析了TCGA数据库中lncRNA GAS8-AS1表达与食管鳞癌患者生存和预后的关系,结果发现,lncRNA GAS8-AS1高表达的患者生存和预后更好(p<0.05)。2.LncRNA GAS8-AS1表达对食管鳞癌细胞生物学特性的影响在lncRNA GAS8-AS1高表达的食管鳞癌细胞系KYSE510和KYSE140中敲低其表达,与对照组相比,GAS8-AS1敲低以后细胞的存活能力明显增强,细胞增殖形成的克隆大小明显增大,更多的细胞进入G1/S期,细胞的凋亡比例明显降低(p<0.05)。在lncRNA GAS8-AS1低表达的食管鳞癌细胞系EC9706中利用过表达质粒过表达lncRNA GAS8-AS1,结果发现,与对照组相比,lncRNA GAS8-AS1过表达以后细胞的存活能力明显减弱,细胞增殖形成的克隆大小明显减小,细胞进入G1/S期的比例也降低,而细胞的凋亡比例明显增多(p<0.05)。3.LncRNA GAS8-AS1过表达能够在体内抑制食管鳞癌的发展我们将lncRNA GAS8-AS1过表达的食管癌细胞系EC9706移植到裸鼠皮下,一段时间后,结果显示,与对照组相比,lncRNA GAS8-AS1过表达形成的肿瘤明显小于对照组,形成肿瘤的比例也显著低于对照组(p<0.05)。4.LncRNA GAS8-AS1影响食管鳞癌发生和发展的分子机制我们通过RNA-seq分析比较了lncRNA GAS8-AS1高表达的食管鳞癌细胞系KYSE510和KYSE140中lncRNA GAS8-AS1敲低和对照组的基因表达差异,结果发现了233个基因在lncRNA GAS8-AS1敲低以后出现表达上调,如DNMT3A、HDAC5等,47个基因在lncRNA GAS8-AS1敲低以后出现表达下调,如PRMT5、Bax等。通过上面的表型实验,我们发现lncRNA GAS8-AS1敲低能够抑制细胞的凋亡,而lncRNA GAS8-AS1过表达能够促进细胞的凋亡,而Bax蛋白又是细胞凋亡通路中的关键经典分子。因此,我们推测lncRNA GAS8-AS1可能通过促进凋亡蛋白Bax的表达抑制细胞的增殖,促进细胞的凋亡,进而抑制食管鳞癌的形成。我们通过qPCR和Western-blot进一步检测了食管鳞癌细胞系KYSE140和EC9706中lncRNA GAS8-AS1对Bax表达的影响。结果提示,在lncRNA GAS8-AS1高表达的食管鳞癌细胞系KYSE140中敲低lncRNA GAS8-AS1的表达,Bax的表达也会降低(p<0.05);在lncRNA GAS8-AS1低表达的食管癌细胞系EC9706中过表达lncRNA GAS8-AS1,Bax的表达则会上升(p<0.05)。随后进一步研究了Bax在食管鳞癌中的基因型情况及蛋白表达。PCR-RFLP结果表明Bax三种基因型GG、AG、AA的例数及分布频率分别为50(66.67%)、16(21.33%)、9(12%)。免疫组化显示Bax在食管鳞癌组织的阳性表达率为42.67%,且Bax基因多态性与Bax蛋白表达呈正相关。进一步研究发现Bax基因多态性与食管鳞癌外膜浸润、分化程度、淋巴转移及临床分期相关。生存分析显示AG+AA型患者预后较好,而GG型患者预后较差。以上结果表明,lncRNA GAS8-AS1可以调控Bax的表达,而Bax基因多态性与食管鳞癌患者的肿瘤分期、淋巴转移及预后相关,因此,lncRNA GAS8-AS1可能通过调控Bax的表达发挥生物学功能。我们进一步探讨了GAS8-AS1调控Bax的机制,网站预测提示GAS8-AS1与靶向Bax的miR-573的相互作用。我们发现miR-573可以和GAS8-AS1形成碱基对,相关性分析显示GAS8-AS1与Bax呈正相关,已有研究显示Bax是miR-573的直接靶基因。采用qPCR和Western-blot发现GAS8-AS1过表达促进了Bax水平上调,而miR-573过表达促进了Bax水平下调,并降低了GAS8-AS1过表达对Bax的影响。细胞凋亡试验显示GAS8-AS1和Bax过表达组凋亡细胞的比例明显升高,而miR-573过表达组凋亡细胞的比例明显降低,并且降低了GAS8-AS1过表达对细胞凋亡的影响。以上结果表明,lncRNA GAS8-AS1可能通过吸附miR-573促进Bax的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。结论本研究发现lncRNA GAS8-AS1在食管鳞癌中存在低表达,且对预后有提示意义。LncRNA GAS8-AS1可能通过吸附miR-573促进凋亡蛋白Bax的表达,从而抑制食管鳞癌细胞的增殖、存活和肿瘤的形成,促进细胞凋亡。因此,lncRNA GAS8-AS1有可能作为临床上食管鳞癌治疗、预后评估的潜在分子靶点。