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第一部分 高迁移率族蛋白B1在新生小鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及机制研究
背景：新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）常留下各种神经系统后遗症。高迁移率族蛋白B1（High Mobility Group Box-1，HMGB1）能被受损的细胞被动释放或受刺激的免疫细胞主动分泌出胞，作为一种损伤相关的分子模式促进炎症反应。临床研究发现HIE患儿脐动脉血HMGB1水平增高，且缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain injury，HIBI）的动物实验模型中发现HMGB1呈时间依赖性释放。由于神经炎症是HIBI重要的病理机制之一，因此，HMGB1在HIBI中神经炎症反应导致的损伤过程中的作用有待进一步研究。
目的：通过使用不同剂量的HMGB1抑制剂Glycyrrhizin（GLY），检测HI后脑中炎症水平、HMGB1及其下游信号通路蛋白表达水平、脑损伤程度及远期神经行为学功能变化，以明确HMGB1在HIBI中的可能作用及机制。
方法：采用Rice-Vannucci经典法制作7d龄新生小鼠HIBI模型。第一阶段实验设为假手术对照组（Sham组）、HI+PBS组和HI+GLY[低剂量组（25mg/Kg）、中等剂量组（50mg/Kg）和高剂量组（100mg/kg）]组共 5组（腹腔注射，qd×3d）；小鼠4-5w大时进行高架十字迷宫、旷场和Morris 水迷宫实验，处死取材后HE染色观察脑组织的形态学改变；免疫荧光染色观察小鼠海马组织髓鞘及神经元情况。第二阶段实验根据第一阶段的实验结果选择最合适的药物剂量，设为Sham组，HI+PBS和HI+GLY组（给药方法同第一阶段）；HI后3d通过qRT-PCR和ELISA检测海马炎症因子水平；Western blot（WB） 检测小鼠海马组织凋亡相关蛋白水平及HMGB1及信号通路相关蛋白水平；免疫荧光染色观察小胶质细胞及星形胶质细胞情况；免疫组化及蛋白核质分离检查HMGB1细胞空间定位。
结果：第一阶段实验结果：1、神经行为学实验结果显示HI+PBS组小鼠较Sham组相比：在水迷宫测试中寻找平台潜伏期显著延长（p<0.001），目标象限停留时间百分比（p<0.05）、穿梭平台次数显著减少（p<0.001）；在高架十字迷宫测试中开臂进入次数及停留时间显著减少（p<0.001）；在旷场实验中中心区进入次数和时间显著减少（p<0.05）；使用HMGB1抑制剂后以上神经行为缺陷获得显著改 善（p<0.05），尤以GLY中剂量组最显著。2、脑组织形态、HE染色及免疫荧光结果显示，HI+PBS组小鼠较Sham组相比，损伤侧脑组织明显缺损，海马及皮层结构完整性被破坏、细胞排列松散、出现空泡变性，大量核致密炎性细胞浸润，海马周围MBP荧光信号强度减弱、神经元NeuN荧光信号出现中断、强度减弱，使用GLY后以上损伤程度减轻，MBP、NeuN荧光强度增强，尤其HI+GLY中剂量组改善最显著。综上，确定GLY 50mg/Kg为最佳药物剂量。第二阶段实验结果：3、凋亡实验结果显示，HI+PBS组小鼠较Sham组相比，tunel阳性染色细胞数增加，而HI+GLY组与HI+PBS组比较显示tunel阳性染色的细胞数量减少；HI损伤后，HI+PBS组小鼠海马Bax表达上升（p<0.05）、Bcl-2表达下降（p<0.05）、cleaved-Caspase-3表达显著上升（p<0.001），在GLY处理后，Bax与cleaved-Caspase-3的表达较HI+PBS组相比均出现显著下降（p<0.01、p<0.001），而Bcl-2表达显著升高（p<0.001）。4、与Sham组相比，HI+PBS组在损伤侧海马及周围区域GFAP和Iba1荧光信号强度增强、密度增加，蛋白表达增加（p<0.001， p<0.01）；而HI+GLY组较HI+PBS组两者荧光信号减弱，密度减低，蛋白表达增加（p<0.01、p<0.001）。5、HI后损伤侧海马炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA和蛋白水平显著升高（分别为p<0.001，p<0.01和p<0.01），抑制HMGB1能降低这种异常升高的水平（分别p<0.01，p<0.05和p<0.05）；HI损伤后，海马组织HMGB1及TLR4、TLR2、MyD88、RAGE、p-NF-κB蛋白表达均显著上升（分别为p<0.05，p<0.01，p<0.01，p<0.01，p<0.001），HI+GLY组与HI+PBS组相比以上蛋白水平出现显著下降（分别为p<0.05，p<0.05，p<0.01，p<0.01，p<0.01， p<0.001）。6、HI+PBS组海马组织HMGB1 mRNA水平较Sham组显著升高（p<0.001），而GLY的使用显著降低HMGB1水平（p<0.001）；免疫组化及蛋白核质分离结果显示，Sham组海马HMGB1主要位于细胞核，HI+PBS组胞质HMGB1显著增加（p<0.001），而HI+GLY组这种重定位现象减弱（p<0.05）。
结论：HMGB1可能参与新生小鼠HIBI发病机制。抑制HMGB1能减轻HI诱导的神经炎症反应、细胞凋亡、髓鞘和神经元损伤以及脑组织的破坏，从而改善小鼠远期神经行为功能。
第二部分 小胶质细胞SIRT1介导的HMGB1乙酰化修饰在新生小鼠缺氧缺血性脑损伤炎症反应中的作用及机制研究
背景：小胶质细胞活化是引起新生小鼠HIBI大脑早期和明显炎症反应的原因。HI损伤的神经元诱导小胶质细胞活化并促进炎症因子释放，导致持续的继发性神经元和少突胶质细胞损伤。本研究的第一部分结果表明通过抑制HMGB1可以有效抑制神经炎症反应，减轻脑损伤。免疫细胞HMGB1乙酰化修饰影响其在细胞空间的分布及分泌，但尚未有研究阐明HIBI中小胶质细胞是否存在HMGB1的分泌及乙酰化修饰。SIRT1在其他疾病模型中能修饰HMGB1，因此我们推测小胶质细胞HMGB1在HI后的动力学变化影响着神经炎症的发生发展，SIRT1可能参与了HMGB1的乙酰化修饰过程。
目的：HI后调节SIRT1，通过检测小鼠脑中炎症水平、脑损伤程度、神经行为改变及小胶质细胞内HMGB1的变化，明确SIRT1在HMGB1参与HIBI发病机制中的作用，并通过体外实验探讨这种作用的分子机制。
方法：体内实验部分：制作新生小鼠HIBI模型，设为Sham组、HI+PBS组、HI+SIRT1激动剂（RES）组和HI+SIRT1抑制剂（EX527）+SIRT1激动剂组（HI后即刻和12h各腹腔注射1次）。小鼠进行圆筒实验、前肢悬吊实验和旷场实验；HI后24h处死取材后HE染色观察脑组织的形态学改变；qRT-PCR和ELISA检测炎症因子水平及HMGB1 mRNA变化；WB 检测SIRT1和TLR4/MyD88/NF-κB水平；免疫荧光染色观察小胶质细胞内HMGB1的空间定位。体外实验部分：对小鼠小胶质细胞系BV2进行氧糖剥夺（Oxygen Glucose Deprivation，OGD）处理以模拟HI过程，设为Control组、OGD+DMSO组、OGD+RES组和OGD+EX527+RES组。qRT-PCR和ELISA检测炎症因子及HMGB1水平变化；WB 检测TLR4/MyD88/NF-κB水平；免疫荧光及核质分离确定HMGB1在胞核和胞质分布情况；通过SIRT1去乙酰化酶活性和免疫共沉淀检测SIRT1对HMGB1修饰作用；检测BV2条件培养基与原代神经元共培养后的上清乳酸脱氢酶（LDH）释放水平及免疫荧光检测神经元内HMGB1定位。
结果：体内实验结果：1、脑组织形态观察，与HI+PBS组相比，HI+RES组脑损伤范围减小， HE染色结果显示SIRT1激动剂处理减轻结构的破坏和炎性细胞浸润，EX527共处理抵消这种修复作用。2、神经行为学实验结果显示，SIRT1 激动剂增加HI后减少的中心区进入次数和停留时间（p<0.05）、改善受损的前肢肌肉力量和肢体活动的的对称性（p<0.01，p<0.05），而抑制SIRT1部分破坏了这种改善作用。3、激活SIRT1降低HI诱导升高的IL-1β、IL-6和TNF-α水平（p<0.001或p<0.01），抑制剂共处理提高以上三种炎症因子水平；WB结果显示HI后SIRT1表达降低（p<0.001），TLR4、MyD88和核NF-κB的表达增加（p值均<0.001），激活SIRT1后SIRT1的表达升高，LR4、MyD88和核NF-κB的表达降低；与HI+PBS组相比，SIRT1抑制剂共处理组未见显著变化；各组之间的HMGB1 mRNA水平无统计学差异。4、免疫荧光结果显示，Sham组中Iba1的表达较弱，HMGB1位于小胶质细胞核中，HI后导致Iba1的荧光强度增加、HMGB1转移至细胞质中；SIRT1激动剂减弱HI诱导的Iba1表达并减少HMGB1细胞质定位，SIRT1抑制剂共处理HMGB1的核外分布显示出增加趋势。体外实验结果：1、RES和EX527的最佳实验药物浓度分别为25μM和100μM，OGD 3h最佳。2、与对照组相比，OGD后IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高（p值均<0.001），TLR4、MyD88和核NF-κB表达显著上升（p值均<0.001），SIRT1激动剂处理后以上分子升高的水平降低（p<0.01或p<0.001）。3、免疫荧光染色结果显示与对照组相比，OGD后细胞核外HMGB1的定位显著增加（p<0.001）， ELISA结果显示细胞上清中的HMGB1含量升高（p<0.001），核质分离后WB显示HMGB1在细胞质中增加（p<0.001）；SIRT1激动剂处理降低HMGB1在细胞质中的水平（p<0.001）；OGD/R后0h或12h HMGB1的mRNA水平无显著差异。4、Co-IP及WB结果显示OGD后SIRT1表达降低（p<0.001），乙酰化HMGB1水平升高，SIRT1激动剂可增加SIRT1的表达及其去乙酰基酶活性（p<0.01）、降低HMGB1的乙酰化水平及抑制HMGB1向胞质移位；SIRT1抑制剂预处理对OGD后SIRT1的表达无显著影响，但可以抑制SIRT1的去乙酰基酶活性（p<0.01）、促进HMGB1的主动分泌。5、BV2 CM与神经元共培养后显示LDH释放水平在OGD后显著上升（p<0.001），SIRT1激动剂处理抑制LDH释放（p<0.001）；免疫荧光共标染色显示来自OGD组的CM导致神经元HMGB1明显的核外定位，而OGD+RES组这种定位现象减弱。
结论：HIBI小胶质细胞可以主动分泌HMGB1参与神经炎症。SIRT1参与HMGB1乙酰化修饰过程，增加SIRT1的表达或活性可降低HMGB1的乙酰化、抑制 HMGB1的分泌，减弱下游炎症级联反应，最终改善HI造成脑损伤和神经行为障碍。通过将HMGB1限制在核内，可能为新生儿HIE的治疗提供新的方向。
背景：新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）常留下各种神经系统后遗症。高迁移率族蛋白B1（High Mobility Group Box-1，HMGB1）能被受损的细胞被动释放或受刺激的免疫细胞主动分泌出胞，作为一种损伤相关的分子模式促进炎症反应。临床研究发现HIE患儿脐动脉血HMGB1水平增高，且缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain injury，HIBI）的动物实验模型中发现HMGB1呈时间依赖性释放。由于神经炎症是HIBI重要的病理机制之一，因此，HMGB1在HIBI中神经炎症反应导致的损伤过程中的作用有待进一步研究。
目的：通过使用不同剂量的HMGB1抑制剂Glycyrrhizin（GLY），检测HI后脑中炎症水平、HMGB1及其下游信号通路蛋白表达水平、脑损伤程度及远期神经行为学功能变化，以明确HMGB1在HIBI中的可能作用及机制。
方法：采用Rice-Vannucci经典法制作7d龄新生小鼠HIBI模型。第一阶段实验设为假手术对照组（Sham组）、HI+PBS组和HI+GLY[低剂量组（25mg/Kg）、中等剂量组（50mg/Kg）和高剂量组（100mg/kg）]组共 5组（腹腔注射，qd×3d）；小鼠4-5w大时进行高架十字迷宫、旷场和Morris 水迷宫实验，处死取材后HE染色观察脑组织的形态学改变；免疫荧光染色观察小鼠海马组织髓鞘及神经元情况。第二阶段实验根据第一阶段的实验结果选择最合适的药物剂量，设为Sham组，HI+PBS和HI+GLY组（给药方法同第一阶段）；HI后3d通过qRT-PCR和ELISA检测海马炎症因子水平；Western blot（WB） 检测小鼠海马组织凋亡相关蛋白水平及HMGB1及信号通路相关蛋白水平；免疫荧光染色观察小胶质细胞及星形胶质细胞情况；免疫组化及蛋白核质分离检查HMGB1细胞空间定位。
结果：第一阶段实验结果：1、神经行为学实验结果显示HI+PBS组小鼠较Sham组相比：在水迷宫测试中寻找平台潜伏期显著延长（p<0.001），目标象限停留时间百分比（p<0.05）、穿梭平台次数显著减少（p<0.001）；在高架十字迷宫测试中开臂进入次数及停留时间显著减少（p<0.001）；在旷场实验中中心区进入次数和时间显著减少（p<0.05）；使用HMGB1抑制剂后以上神经行为缺陷获得显著改 善（p<0.05），尤以GLY中剂量组最显著。2、脑组织形态、HE染色及免疫荧光结果显示，HI+PBS组小鼠较Sham组相比，损伤侧脑组织明显缺损，海马及皮层结构完整性被破坏、细胞排列松散、出现空泡变性，大量核致密炎性细胞浸润，海马周围MBP荧光信号强度减弱、神经元NeuN荧光信号出现中断、强度减弱，使用GLY后以上损伤程度减轻，MBP、NeuN荧光强度增强，尤其HI+GLY中剂量组改善最显著。综上，确定GLY 50mg/Kg为最佳药物剂量。第二阶段实验结果：3、凋亡实验结果显示，HI+PBS组小鼠较Sham组相比，tunel阳性染色细胞数增加，而HI+GLY组与HI+PBS组比较显示tunel阳性染色的细胞数量减少；HI损伤后，HI+PBS组小鼠海马Bax表达上升（p<0.05）、Bcl-2表达下降（p<0.05）、cleaved-Caspase-3表达显著上升（p<0.001），在GLY处理后，Bax与cleaved-Caspase-3的表达较HI+PBS组相比均出现显著下降（p<0.01、p<0.001），而Bcl-2表达显著升高（p<0.001）。4、与Sham组相比，HI+PBS组在损伤侧海马及周围区域GFAP和Iba1荧光信号强度增强、密度增加，蛋白表达增加（p<0.001， p<0.01）；而HI+GLY组较HI+PBS组两者荧光信号减弱，密度减低，蛋白表达增加（p<0.01、p<0.001）。5、HI后损伤侧海马炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA和蛋白水平显著升高（分别为p<0.001，p<0.01和p<0.01），抑制HMGB1能降低这种异常升高的水平（分别p<0.01，p<0.05和p<0.05）；HI损伤后，海马组织HMGB1及TLR4、TLR2、MyD88、RAGE、p-NF-κB蛋白表达均显著上升（分别为p<0.05，p<0.01，p<0.01，p<0.01，p<0.001），HI+GLY组与HI+PBS组相比以上蛋白水平出现显著下降（分别为p<0.05，p<0.05，p<0.01，p<0.01，p<0.01， p<0.001）。6、HI+PBS组海马组织HMGB1 mRNA水平较Sham组显著升高（p<0.001），而GLY的使用显著降低HMGB1水平（p<0.001）；免疫组化及蛋白核质分离结果显示，Sham组海马HMGB1主要位于细胞核，HI+PBS组胞质HMGB1显著增加（p<0.001），而HI+GLY组这种重定位现象减弱（p<0.05）。
结论：HMGB1可能参与新生小鼠HIBI发病机制。抑制HMGB1能减轻HI诱导的神经炎症反应、细胞凋亡、髓鞘和神经元损伤以及脑组织的破坏，从而改善小鼠远期神经行为功能。
第二部分 小胶质细胞SIRT1介导的HMGB1乙酰化修饰在新生小鼠缺氧缺血性脑损伤炎症反应中的作用及机制研究
背景：小胶质细胞活化是引起新生小鼠HIBI大脑早期和明显炎症反应的原因。HI损伤的神经元诱导小胶质细胞活化并促进炎症因子释放，导致持续的继发性神经元和少突胶质细胞损伤。本研究的第一部分结果表明通过抑制HMGB1可以有效抑制神经炎症反应，减轻脑损伤。免疫细胞HMGB1乙酰化修饰影响其在细胞空间的分布及分泌，但尚未有研究阐明HIBI中小胶质细胞是否存在HMGB1的分泌及乙酰化修饰。SIRT1在其他疾病模型中能修饰HMGB1，因此我们推测小胶质细胞HMGB1在HI后的动力学变化影响着神经炎症的发生发展，SIRT1可能参与了HMGB1的乙酰化修饰过程。
目的：HI后调节SIRT1，通过检测小鼠脑中炎症水平、脑损伤程度、神经行为改变及小胶质细胞内HMGB1的变化，明确SIRT1在HMGB1参与HIBI发病机制中的作用，并通过体外实验探讨这种作用的分子机制。
方法：体内实验部分：制作新生小鼠HIBI模型，设为Sham组、HI+PBS组、HI+SIRT1激动剂（RES）组和HI+SIRT1抑制剂（EX527）+SIRT1激动剂组（HI后即刻和12h各腹腔注射1次）。小鼠进行圆筒实验、前肢悬吊实验和旷场实验；HI后24h处死取材后HE染色观察脑组织的形态学改变；qRT-PCR和ELISA检测炎症因子水平及HMGB1 mRNA变化；WB 检测SIRT1和TLR4/MyD88/NF-κB水平；免疫荧光染色观察小胶质细胞内HMGB1的空间定位。体外实验部分：对小鼠小胶质细胞系BV2进行氧糖剥夺（Oxygen Glucose Deprivation，OGD）处理以模拟HI过程，设为Control组、OGD+DMSO组、OGD+RES组和OGD+EX527+RES组。qRT-PCR和ELISA检测炎症因子及HMGB1水平变化；WB 检测TLR4/MyD88/NF-κB水平；免疫荧光及核质分离确定HMGB1在胞核和胞质分布情况；通过SIRT1去乙酰化酶活性和免疫共沉淀检测SIRT1对HMGB1修饰作用；检测BV2条件培养基与原代神经元共培养后的上清乳酸脱氢酶（LDH）释放水平及免疫荧光检测神经元内HMGB1定位。
结果：体内实验结果：1、脑组织形态观察，与HI+PBS组相比，HI+RES组脑损伤范围减小， HE染色结果显示SIRT1激动剂处理减轻结构的破坏和炎性细胞浸润，EX527共处理抵消这种修复作用。2、神经行为学实验结果显示，SIRT1 激动剂增加HI后减少的中心区进入次数和停留时间（p<0.05）、改善受损的前肢肌肉力量和肢体活动的的对称性（p<0.01，p<0.05），而抑制SIRT1部分破坏了这种改善作用。3、激活SIRT1降低HI诱导升高的IL-1β、IL-6和TNF-α水平（p<0.001或p<0.01），抑制剂共处理提高以上三种炎症因子水平；WB结果显示HI后SIRT1表达降低（p<0.001），TLR4、MyD88和核NF-κB的表达增加（p值均<0.001），激活SIRT1后SIRT1的表达升高，LR4、MyD88和核NF-κB的表达降低；与HI+PBS组相比，SIRT1抑制剂共处理组未见显著变化；各组之间的HMGB1 mRNA水平无统计学差异。4、免疫荧光结果显示，Sham组中Iba1的表达较弱，HMGB1位于小胶质细胞核中，HI后导致Iba1的荧光强度增加、HMGB1转移至细胞质中；SIRT1激动剂减弱HI诱导的Iba1表达并减少HMGB1细胞质定位，SIRT1抑制剂共处理HMGB1的核外分布显示出增加趋势。体外实验结果：1、RES和EX527的最佳实验药物浓度分别为25μM和100μM，OGD 3h最佳。2、与对照组相比，OGD后IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高（p值均<0.001），TLR4、MyD88和核NF-κB表达显著上升（p值均<0.001），SIRT1激动剂处理后以上分子升高的水平降低（p<0.01或p<0.001）。3、免疫荧光染色结果显示与对照组相比，OGD后细胞核外HMGB1的定位显著增加（p<0.001）， ELISA结果显示细胞上清中的HMGB1含量升高（p<0.001），核质分离后WB显示HMGB1在细胞质中增加（p<0.001）；SIRT1激动剂处理降低HMGB1在细胞质中的水平（p<0.001）；OGD/R后0h或12h HMGB1的mRNA水平无显著差异。4、Co-IP及WB结果显示OGD后SIRT1表达降低（p<0.001），乙酰化HMGB1水平升高，SIRT1激动剂可增加SIRT1的表达及其去乙酰基酶活性（p<0.01）、降低HMGB1的乙酰化水平及抑制HMGB1向胞质移位；SIRT1抑制剂预处理对OGD后SIRT1的表达无显著影响，但可以抑制SIRT1的去乙酰基酶活性（p<0.01）、促进HMGB1的主动分泌。5、BV2 CM与神经元共培养后显示LDH释放水平在OGD后显著上升（p<0.001），SIRT1激动剂处理抑制LDH释放（p<0.001）；免疫荧光共标染色显示来自OGD组的CM导致神经元HMGB1明显的核外定位，而OGD+RES组这种定位现象减弱。
结论：HIBI小胶质细胞可以主动分泌HMGB1参与神经炎症。SIRT1参与HMGB1乙酰化修饰过程，增加SIRT1的表达或活性可降低HMGB1的乙酰化、抑制 HMGB1的分泌，减弱下游炎症级联反应，最终改善HI造成脑损伤和神经行为障碍。通过将HMGB1限制在核内，可能为新生儿HIE的治疗提供新的方向。