研究背景人类疾病的发病是由基因与环境的相互作用引起的,而生活在人体体内和人体表面的微生物目前是公认的引起人类疾病的重要环境因素。随着多组学技术的发展,包括人类微生物组计划(Human Microbiome Project,HMP)在内的人类微生物组研究产生了丰富的资源,证实了肠道微生物通过肠-脑轴对精神疾病患病中大脑功能和行为的潜在影响,如精神分裂症、焦虑症和抑郁症。在重度抑郁障碍(Major depressive disorder,MDD)患者粪便样本中,肠道微生物组分存在显著改变,且这种改变存在明显的性别差异。通过将抑郁障碍患者的粪便样本移植到无菌鼠体内成功构建肠道菌群重塑小鼠后,小鼠表现出明显的抑郁和焦虑样行为,提示肠道菌群紊乱在抑郁障碍发病中的病因作用。然而,介导肠道微生物对大脑功能和行为影响的潜在机制是非常复杂的,至今仍不清楚。蛋白质是生命活动的主要承担者,它的功能由不同的翻译后修饰(Posttranslational modifications,PTMs)调节,PTMs是调节各种细胞过程的关键方式。赖氨酸乙酰化是最丰富且进化上最保守的PTMs类型之一。研究表明,组蛋白乙酰化修饰被认为是肠道微生物影响抑郁样行为的潜在机制。同时,不同细胞室中数以千计的非组蛋白也可发生Lys乙酰化修饰,这种修饰可参与调节细胞内多种生物学过程。含有乙酰化赖氨酸溴结构域的蛋白质可与其他PTMs发生乙酰化串扰,例如:琥珀酰修饰。赖氨酸的酰化修饰是一种功能修饰,它可能在宿主与微生物的相互作用机制中扮演着重要角色。目的为了进一步解在肠道微生物紊乱的情况下,宿主赖氨酸乙酰化(Kac)和赖氨酸琥珀酰化(Ksucc)修饰位点的系统性改变,以及探索肠道微生物紊乱诱导抑郁样行为的潜在机制。方法1.采用MDD患者和健康对照者的200ul粪便混合悬浮液对GF小鼠进行灌胃,分别构建“抑郁菌群”受体小鼠和“健康菌群”受体小鼠。2.采用了串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)、Kac/Ksucc亲和富集法、联合液相色谱-质谱/质谱法(Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS)的定量蛋白组学技术,对“抑郁菌群”受体小鼠和“健康菌群”受体小鼠海马组织中的乙酰化和琥珀酰化修饰蛋白进行了蛋白质组学检测分析。3.为了评估肠道微生物紊乱是否在调节蛋白质修饰过程中具有结构偏好性,我们分别对Kac和Ksucc修饰肽段序列进行了基序分析和PTM关联性分析。4.为了揭示在肠道微生物紊乱中差异修饰蛋白的结构和功能,我们分别对差异Kac和Ksucc修饰蛋白进行了二级结构预测和亚细胞定位分析。5.为了进一步揭示差异乙酰化和琥珀酰化修饰蛋白的生物学功能。我们分别对差异Kac和Ksucc修饰蛋白进行了GO功能注释和KEGG通路分析以及蛋白-蛋白互作网络分析。6.为了鉴定受Lys乙酰化和琥珀酰化修饰调节的复合物,我们分别对差异Kac和Ksucc修饰蛋白进行了蛋白复合物分析。结果1.本研究总共鉴定到665个蛋白中1211个位点发生了乙酰化修饰,1194个蛋白中1945个位点发生了琥珀酰化修饰,这些位点的乙酰化和琥珀酰化修饰水平与其上下游的其他修饰类型存在相关性表达,例如:泛素化、甲基化等。此外,乙酰化修饰常发生在具有KacK保守基序的肽段上,而琥珀酰化修饰常发生在具有Kac*E保守基序的肽段上。2.在这些鉴定的修饰位点中,223种蛋白中315个Kac位点、494种蛋白中624个Ksucc位点具有显著差异。这些差异Kac和Ksucc位点主要位于蛋白二级结构中的无规则卷曲,其次是α螺旋和β折叠链,且位于蛋白表面的乙酰化和琥珀酰化修饰可改变蛋白的表面特性。差异Kac蛋白主要位于细胞核和线粒体,而Ksucc蛋白广泛分布于各细胞器。3.肠道微生物紊乱引起的乙酰化修饰蛋白改变主要与碳代谢扰乱有关,同时可通过降低组蛋白乙酰化修饰水平来抑制基因表达。4.功能分析发现,肠道微生物紊乱可通过蛋白琥珀酰化修饰水平改变引起宿主广泛的生物学过程发生明显扰乱,其中突触囊泡循环改变最显著;此外,还可通过改变核糖体蛋白琥珀酰化修饰水平影响蛋白翻译过程。5.重叠分析发现,许多功能通路中相关蛋白可同时发生乙酰化和琥珀酰化,例如:氨基酸合成、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle,TCA)和氧化磷酸化等,这些生物学过程部分或唯一地发生在线粒体内。此外,MAPK信号通路相关蛋白复合体也可同时被乙酰化和琥珀酰化修饰。结果提示,肠道微生物紊乱可通过乙酰化和琥珀酰化修饰的相互作用共同引起线粒体功能障碍及MAPK信号通路紊乱。结论在肠道微生物紊乱小鼠中鉴定到大量的乙酰化和琥珀酰化修饰位点。其中,与“健康菌群”受体小鼠相比,“抑郁菌群”受体小鼠中223种蛋白中315个Kac位点、494种蛋白中624个Ksucc位点具有显著差异。乙酰化修饰蛋白改变主要与碳代谢扰乱有关;同时,肠道微生物紊乱还可通过降低组蛋白乙酰化修饰水平来抑制基因表达。然而,对差异琥珀酰化修饰蛋白的功能分析发现,突触囊泡循环改变最显著;另外,肠道微生物紊乱还可通过改变核糖体蛋白琥珀酰化修饰水平影响蛋白翻译过程。此外,肠道微生物紊乱可通过乙酰化和琥珀酰化修饰的相互作用共同引起线粒体功能障碍及MAPK信号通路紊乱。此研究为探索抑郁障碍的发病机制提供了一个全新的视角,并为探索基于肠道微生物干预的抑郁障碍治疗手段提供了可能的理论依据及潜在的作用靶点。研究背景在过去的十年里,越来越多的新证据表明,肠道微生物可能通过肠-脑轴调节大脑功能和行为,肠道微生物紊乱在精神疾病发病中也发挥重要的调节作用。前期的研究结果表明,肠道微生物紊乱可能引起机体抑郁和焦虑样行为,然而肠道微生物群的缺失可导致无菌小鼠(Germ free,GF)基础抑郁和焦虑样行为的减少,同时伴有下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)相关基因表达的改变。在GF鼠中肠道微生物的定植是探索肠道微生物对大脑功能潜影响的重要组成部分。近几十年来,越来越多的研究试图通过分析转录组水平变化来揭示精神疾病的神经生物学机制。这些非蛋白编码转录本已成为人们关注的重点,研究发现它们是调节多种细胞内生理病理学过程的关键调控因子,从而参与疾病的发生发展。这些非蛋白编码转录本包括假基因、环状RNAs(c RNAs)、micro RNAs(mi RNAs)和长链非编码RNAs(lnc RNAs)。根据lnc RNA基因座相对于蛋白质编码基因的位置,一个被称为长链基因间非编码RNA(Long intergenic noncoding RNAs,linc RNAs)的亚群被鉴定出来。我们前期的研究发现,肠道微生物的缺乏会导致小鼠海马组织中mi RNAs和m RNAs的表达异常,其中海马被广泛认为是情绪情感产生和调节的关键脑区。因此,我们假设GF小鼠海马组织中linc RNA表达的改变可能与这些显著变化的mi RNAs和m RNAs有关。然而,肠道微生物是如何通过lincRNA-mi RNA-m RNA网络调节大脑功能的具体机制仍不清楚。目的1.分析肠道微生物调节的特异linc RNAs,mi RNAs和m RNAs。2.基于linc RNA-mi RNA-m RNA网络构建,进一步了解肠道微生物调控大脑功能的分子机制。方法1.为了进一步了解肠道微生物与大脑相互作用的分子基础,我们采用无偏倚的转录组学分析方法测定了无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)小鼠、GF小鼠和重定植GF(colonized GF,CGF)小鼠海马组织中linc RNAs的表达水平。2.为了评估受肠道微生物调节的特异转录本,我们筛选了肠道微生物重定植以后显著逆转的linc RNAs、mi RNAs和m RNAs。我们将逆转基因定义为在GF vs.SPF和CGF vs.GF比较组中表达水平变化方向相反的基因。3.我们采用DIANA Lnc Base v2软件预测mi RNAs的靶向lnc RNAs;采用mi RDB软件、Target Scan软件、mi RTar Base软件和DIANA-Tar Base v8软件,以及Ingenuity Pathway analysis(IPA)软件的micro RNA靶向筛选分析模块对mi RNAs的靶向m RNAs进行了预测。4.为了进一步了解这些具有显著差异的转录本的生物学功能,我们分别对m RNAs和mi RNAs与linc RNAs的靶基因进行了通路富集和功能网络分析。5.我们对lincRNAs、mi RNAs和mRNAs相互作用关系进行了全面分析,以全面了解微生物群调控的linc RNA-mi RNA-m RNA网络。结果1.根据fold-change≥2且p值<0.05的筛选标准,在GF vs.SPF、CGF vs.SPF和CGF vs.GF比较组中均发现了大量差异表达的linc RNAs、mi RNAs和m RNAs。2.肠道微生物的缺失导致基因表达水平明显改变,总计1050个m RNAs上调和3573个m RNAs下调。其中,139个m RNAs的表达水平在肠道微生物重定植以后显著逆转,这些逆转的DEGs主要与神经元内CREB信号通路干扰有关,并在RNA转录和m RNA翻译中起着重要作用。3.与SPF小鼠相比,GF小鼠中有17个mi RNAs上调和33个mi RNAs下调。其中7个mi RNAs的表达水平在肠道微生物重定植以后显著逆转。根据mi RNAs与靶向m RNAs之间的负调控关系,仅有6个mi RNAs和32个m RNAs被保留。许多基因在Ras/MAPK信号通路中发挥作用,并可能与RNA转录和转录后调控有关。4.在GF vs.SPF、CGF vs.SPF和CGF vs.GF三个比较组中,共发现678个差异表达的linc RNAs。然而,只有一个linc RNA的表达水平在肠道微生物重定植以后逆转,即linc RNA0926。Linc RNA0926可负调控其邻近基因Celf4。linc RNA0926-Celf4相互作用可能在肠道微生物缺失引起的RNA剪接功能障碍中发挥潜在作用。5.在最终的肠道微生物调节的linc RNA-mi RNA-m RNA调控网络中,包含12个linc RNAs、6个mi RNAs和47个m RNAs。linc RNA0926-mmu-mi R-190a-5p-Celf4相互作用关系可能在该调节网络中起关键作用。结论综上所述,我们发现肠道微生物的缺乏会导致GF小鼠海马组织中转录组表达改变,同时伴随着焦虑样行为的明显减少。使用CGF小鼠的补充研究显示139个m RNAs、7个mi RNAs和1个linc RNA的表达水平在肠道微生物重定值以后显著逆转,然而行为改变并未被逆转。对逆转m RNAs、mi RNAs和linc RNAs进行的功能分析结果表明,这些逆转的转录本可能与CREB和Ras/MAPK信号通路紊乱有关。蛋白互作网络分析结果提示,在肠道微生物紊乱中,RNA转录和转录后调控失调是改变最显著的功能障碍。根据RNA-RNA相互作用,共计有12个linc RNAs、6个mi RNs A和47个m RNs A被纳入最终的linc RNA-mi RNA-m RNA调控网络,linc RNA0926-mi R-190a-5p-Celf4相互作用可能在肠道微生物调控网络中发挥关键作用。