研究背景 细胞凋亡的异常减少是肿瘤发生发展的重要特征，因此促使肿瘤细胞凋亡被认为是治疗肿瘤的有效手段。经典的凋亡途径包括：线粒体通路(内源性途径)和死亡受体通路(外源性途径)，大多数抗癌药物是通过上述途径诱导肿瘤细胞凋亡从而发挥治疗作用的。 肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Fac-tor-relatedApoptosis-indllcing Ligand，TRAIL)是肿瘤坏死因子家族新成员，属于Ⅱ型膜糖蛋白。它的细胞外部分被特定的酶降解后形成可溶性分子，能与靶细胞表面的死亡受体特异性结合诱导多种组织来源的转化细胞株及肿瘤细胞株凋亡，同时对正常细胞的影响较小，因而是广受瞩目的潜在的肿瘤治疗手段。尽管在多项体内外研究中展现了良好的应用前景，但TRAIL作为抗癌药物仍然面临两个问题：一方面，TRAIL仍然面临着化疗药物普遍存在的耐药性难题；另一方面，当TRAIL超过一定浓度后，将丧失对肿瘤细胞的选择性杀伤作用，诱导正常细胞凋亡而带来副作用。与此同时，越来越多的报道显示，多种化疗药物可以增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，在不增加毒性作用的前提下提高疗效。因此，探索高效的TRAIL配伍使用方案具有重要的意义。 已有的研究表明：As<,2>O<,3>可以直接作用于线粒体通透性转运孔道(MPTP)蛋白质巯基，促使线粒体电位下降，进而导致细胞凋亡。As<,2>O<,3>直接损伤线粒体从而启动细胞凋亡程序的特点使其避开凋亡通路上线粒体上游的环节，减少了耐药的发生，因此对许多耐药模型有效。 研究目的 研究As<,2>O<,3>与rhTRAIL这个配伍用药方案对体外培养的胃癌细胞生长与凋亡的影响，并研究其发生机制，旨在探索胃癌治疗新方案。 研究方法 1 As<,2>O<,3>与rhTRAIL抗胃癌细胞SGC7901的协同作用 ①分别用梯度浓度的As<,2>O<,3>和rhTRAIL经不同时间处理人胃癌SGC7901细胞； ②MTT法检测细胞生长抑制率，计算出两药的IC<,50>值； ③荧光显微镜观察细胞核内染色质的变化(Hochest33258荧光染色和AO/EB双荧光染色法)； ④琼脂糖凝胶电泳分析肿瘤细胞内生化指标的变化，看是否有DNA ladder出现； ⑤用AnnexinV-FITC和PI双染色流式细胞术定量检测细胞凋亡； ⑥分别用细胞毒性剂量(5μmol/L)和亚毒性剂量(lμmol/L)As<,2>O<,3>联合rhTRAIL处理SGC7901细胞，根据金正均方法判断药物相互作用效应； 2 线粒体途径参与rhTRAIL与As<,2>O<,3>诱导胃癌细胞SGC7901凋亡 ①DiOC6荧光染色流式细胞术检测各组细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的变化； ②AnnexinV-FITC和PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡； ③比色法检测各组细胞Caspase-8、9活性。 3 As<,2>O<,3>对SGC7901细胞TRAIL死亡受体及cFLIP基因表达的影响 ①半定量RT-PCR和Western blot检测As<,2>O<,3>处理前后TRAIL受体(DR<,4>，DR<,5>)和cFLIP(cFLIPL，cFLIPs)基因在mRNA和蛋白水平的表达； ②间接免疫荧光染色流式细胞术检测As203处理前后SGC7901细胞表面TRAIL死亡受体的表达。 研究结果 1 As<,2>O<,3>与rhTRAIL抗胃癌细胞SGC7901的协同作用 ①As<,2>O<,3>和rhTAIL单独应用均可以呈浓度和时间依赖性地抑制SGC7901细胞的生长，两药处理72h的IC<,50>分别为15.17μmol/L和384.35μg/L； ②As<,2>O<,3>和rhTRAIL单独或联合处理SGC7901细胞后，处理组部分细胞荧光显微镜下显示凋亡细胞特有的染色质变化征象； ③一定浓度的As<,2>O<,3>和rhTRAIL作用48 h后，提取细胞DNA行琼脂糖电泳分析，呈现出细胞凋亡时典型的DNA梯状条带； ④ Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测发现一定浓度范围内As<,2>O<,3>和rhTRAIL处理后，SGC7901细胞凋亡率显著增加； ⑤5μmol/L(细胞毒性剂量)As<,2>O<,3>和200μg/LrhTRAIL联合处理后，SGC7901细胞生长抑制率与凋亡率显著升高，金正均方法分析表明两药联用对细胞生长抑制、凋亡诱导有增强作用： ⑥亚细胞毒性浓度(1μmol/L)As<,2>O<,3>增敏rhTRAIL对SGC7901细胞的生长抑制、凋亡诱导作用。 2 线粒体途径参与rhTRAIL与As<,2>O<,3>诱导胃癌细胞SGC7901凋亡 ①As<,2>O<,3>与rhTRAIL均可以时间依赖性地导致SGC7901细胞线粒体跨膜电位下降，As<,2>O<,3>+TRAIL组SGC7901细胞△ψm下降程度大于单用任何一种药物； ② rhTRAIL组细胞Caspase-8、9活性较对照组明显升高；As<,2>O<,3>组细胞Caspase-9活性较对照组明显升高； ③ caspase-8抑制剂Z-IETD-fmk部分拮抗rhTRAIL诱导的△ψm下降、Caspase-8、9活性升高与凋亡发生，而对As<,2>O<,3>的效应无显著影响； ④二硫键还原剂(DTT)部分拮抗As<,2>O<,3>诱导的△ψm下降、Caspase-9活性升高与凋亡发生，而对rhTRAIL的效应无显著影响。 3 As<,2>O<,3>对SGC7901细胞TRAIL死亡受体及cFLIP基因表达的影响 ①SGC7901细胞存在TRAIL受体(DR<,4>，DR<,5>)在mRNA、总蛋白质以及细胞表面蛋白质等水平的表达；As<,2>O<,3>(1μmol/L)与As<,2>O<,3>(5μmol/L)联合rsTRML或单独处理均可上调SGC7901细胞TRAIL受体(DR<,4>，DR<,5>)在各个水平的表达； ②SGC7901细胞存在cFLIP(cFLIPL，cFLIPs)基因在mRNA和蛋白质水平的表达；As<,2>O<,3>处理对cFLIP(cFLIPL，cFLIPs)基因mRNA、蛋白质表达水平无影响。 研究结论 1 As<,2>O<,3>与rhTRAIL可以呈浓度、时间依赖性的抑制SGC7901细胞生长，诱导其凋亡；不同浓度As<,2>O<,3>与rhTRAIL联用均有协同抑制SGC7901细胞生长，诱导其凋亡的效应。 2 As<,2>O<,3>通过破坏线粒体膜上蛋白质巯基从而直接激活线粒体相关途径诱导SGC7901细胞凋亡；rhTRAIL与受体结合后可能通过caspase-8间接激活线粒体途径诱导SGC7901细胞凋亡；As<,2>O<,3>与rhTRAIL联用时，各自通过不同途径作用于SGC7901细胞线粒体，增加其跨膜电位的降低以及由此导致的细胞凋亡，从而在诱导细胞凋亡方面形成协同作用。 3 不同浓度As<,2>O<,3>可以通过上调SGC7901细胞死亡受体(DR<,4>，DR<,5>)mRNA水平、细胞总蛋白质水平、细胞表面蛋白水平的表达，增强其对TRAIL的敏感性；SGC7901细胞有cFLIP<,L>与cFLIPs基因的mRNA与蛋白表达，这可能是其相对耐药的分子机制；As<,2>O<,3>上调SGC7901细胞对TRAIL的敏感性不是通过对cFLIP基因表达的影响。