【摘 要】
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该课题组以往的研究进展已经为转基因小鼠的建立奠定了良好的基础:我们应用未免疫小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合,成功筛选到了4株分泌抗角蛋白IgM抗体的杂交瘤,并发现单克隆抗角
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该课题组以往的研究进展已经为转基因小鼠的建立奠定了良好的基础:我们应用未免疫小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合,成功筛选到了4株分泌抗角蛋白IgM抗体的杂交瘤,并发现单克隆抗角蛋白抗体的亲和力差异很大.这些更具天然性的未免疫小鼠杂交瘤抗体的获得不仅有助于我们进一步探讨AK auto Ab的特性和生物学作用,更为深入研究AK auto Ab的产生机制等长久以来困扰我们的难题提供了非常好的实验材料.该研究首先从小鼠表皮提取了小鼠角蛋白,然后应用NH<,4>SCN洗脱法比较了天然抗角蛋白杂交瘤抗体的相对亲和力,选择高亲和力的抗角蛋白抗体用以构建转基因小鼠,并初步进行了表型分析.一、转基因载体构建及表达;采用RT-PCR方法克隆分泌AK auto Ab的杂交瘤3B4的重链和轻链可变区基因,连接抗体转录启动子、增强子及恒定区基因序列,构建成重链转基因质粒pICμ-V<,2H7>和轻链转基因质粒pBSCk-2Vk4.电穿孔法进行了体外真核细胞转染,ELISA、RT-PCR、流式细胞仪方法验证转基因载体可以表达抗体3B4基因.二、抗体重链转基因小鼠建立及基因型分析;将线性化的质粒显微注射入CBA×C57BL/6小鼠的受精卵细胞的雄前核内,然后导入假孕雌鼠的输卵管.共注射约200枚卵,娩出小鼠80只.提取小鼠尾巴基因组DNA进行PCR分析,共获得12只转基因阳性小鼠.Southern blot分析进一步证实转基因存在.三、抗体重链转基因小鼠表型分析;四、AK auto Ab产生的细胞基础研究;该研究成功建立了AK auto Ab的转基因小鼠模型,为进一步在体研究AK auto Ab的功能作用奠定了良好的基础;并利用转基因小鼠初步分析了AK auto Ab的产生机理,明确了AK auto Ab产生的细胞基础.
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