慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见的慢性气道炎症性疾病,表现为持续的气道炎症细胞浸润、不完全可逆的气流受限、粘液过度分泌和气道重构等特征。众所周知,吸烟是引发COPD的最为重要的危险因素,然而,其机制目前仍未完全阐明。一种为大家广泛接受的观点是局部免疫失调是COPD发病过程中的重要环节。临床研究结果显示Tel与Thl7细胞与COPD的关系较为密切。动物实验也证实,Th1和Th17细胞在吸烟诱导的肺部炎症中起重要作用。COPD的一个重要特征是持续的炎症反应,包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞。目前,嗜酸性粒细胞在COPD中的作用并不明确。尽管嗜酸性粒细胞通常与过敏性疾病(如支气管哮喘)和寄生虫感染的关系较为密切,但是临床研究表明,部分COPD患者外周血和／或诱导痰标本中嗜酸性粒细胞的比例有明显上升。COPD的治疗常常用到糖皮质激素,而其疗效往往不尽如人意。然而,嗜酸性粒细胞比例较高的患者对激素的反应较好。这一现象提示,嗜酸性粒细胞至少在部分COPD患者的发病过程起作用。传统观点认为,嗜酸性粒细胞作为一种终末分化的细胞,通过脱颗粒过程释放一些炎症介质,在固有免疫过程中发挥作用。近年来的研究则表明,嗜酸性粒细胞对于适应性免疫反应具有调节作用。在嗜酸性粒细胞缺失的小鼠体内Th2型免疫反应明显受到抑制,而且不能通过过继活化的DC来重建。只有同时过继嗜酸性粒细胞和活化的DC才能重建Th2型免疫反应和气道炎症。COPD是一种以Th1, Th17型免疫反应占优势的疾病,那么嗜酸性粒细胞细胞是否也能调控Th1, Th17的作用进而改变气道炎症反应?针对以上假设,我们利用嗜酸性粒细胞缺失的小鼠(PHIL),将其与WT小鼠共同暴露于香烟烟雾中,观察气道炎症反应,肺部和脾脏的T细胞亚群的变化。结果显示,与WT小鼠相比,PHIL小鼠的气道炎症明显较弱,肺部和脾脏的Th17/Tc17细胞的比例下降,但是对Th1/Tc1的比例并无明显影响。与此同时,PHIL小鼠BALF和肺组织匀浆的IFN-γ的浓度明显上升,而IL-17A的水平仅有微弱的上升。我们的研究结果表明,嗜酸性粒细胞通过Th17/Tc17细胞来调控吸烟诱导的肺部炎症反应。第一部分烟雾暴露诱导的小鼠肺部损伤模型的建立目的：建立烟雾暴露诱导的小鼠肺部损伤模型,观察小鼠在烟雾暴露下气道炎症以及T细胞免疫反应的动态变化。方法：将183只C57BL/6小鼠(雄性,8-10周)随机分为两组,93只吸烟组小鼠置于全身暴露装置中,给予烟雾暴露(100支烟／天,5天/周),其余90只对照组小鼠暴露于空气中。在两组下面,根据暴露时间再分为6个亚组,暴露时间设定为1周,2周,4周,8周,12周和24周。在每一个时间点,处理相应亚组的小鼠。一部分小鼠左肺取支气管肺泡灌洗液(BALF),进行细胞总数与分类的计数,然后用4%多聚甲醛固定,制成病理切片观察炎症浸润与肺气肿形成情况；取右肺用于提取mRNA和蛋白,用定荧光量PCR和ELISA法检测相关分子的表达和分泌。另一部分小鼠的双肺,剪碎后经胶原酶消化,研磨制成细胞悬液,然后用淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞悬液,经过刺激后以流式细胞术检测肺组织中各个T细胞亚型的变化。脾脏直接研磨后制成细胞悬液经过刺激后以流式细胞术检测肺组织中各个T细胞亚型的变化。结果：烟雾暴露使小鼠肺部有大量炎症细胞浸润,早期主要聚集于大气道周围,随着暴露时间的延长,小气道周围也有大量炎症细胞浸润。烟雾暴露12周炎症反应最为明显,烟雾暴露组的炎症评分远高于对照组(2.250.22vs.1.00±0.21,P<0.001)。烟雾暴露24周后,虽然炎症反应有所减轻,然而肺泡内衬间隔(MLI)明显增大(94.38±6.45vs.70.20±4.45μm, P<0.05),肺气肿形成。烟雾暴露极大地增加了BALF中细胞的数量,巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量都有明显的上升。其中,中性粒细胞的变化最为明显,其峰值出现在12周((2.77±1.07)×104/ml vs.(9.75±1.60)×104/ml, P<0.01).中长期烟雾暴露使肺部Tcl,Th17以及Tc17细胞的比例明显上升,同样在12周最为明显(Tcl:(43.63±3.25)％vs.(56.58±2.28)％, P<0.05:Th17:(11.25±1.92)％vs.(19.58±2.31)％, P<0.05； Tc17:(5.96±0.17)％vs.(8.53±0.78)％, P<0.05).与肺部的情况相似,烟雾暴露也能使脾脏的Tcl,Thl7以及Tc17细胞扩增。烟雾暴露明显地提高了肺组织IFN-γ和IL-17A的表达水平(12周达到最高水平,分别达到13.46倍和12.13倍),同时也使两者在BALF和肺组织匀浆中的含量上升。此外,烟雾暴露显著地提高了肺组织中趋化因子(CCL2,CXCL1和CXCL2)和前炎症因子(IL-6,TNF-α和IL-1β)的表达水平。结论：烟雾暴露能够先后引发小鼠肺部炎症以及肺气肿,且在不同阶段病理改变不尽一致。中长期烟雾暴露诱导Tc1.Th17以及Tc17三种T细胞亚群的增殖,不仅改变了局部T细胞亚群的比例,而且对远隔部位的T细胞亚群也有明显的影响。第二部分嗜酸性粒细胞在香烟烟雾暴露诱导的小鼠肺部损伤模型中的作用目的：观察嗜酸性粒细胞在烟雾暴露模型中对小鼠气道炎症以及T细胞免疫反应的影响。方法：将同窝生的WT与PHIL小鼠随机分为对照组(WT/CON,PHIL/CON)和烟雾暴露组(WT/CS,PHIL/CS),利用前一部分的方法构建动物模型,共暴露12周。一部分小鼠左肺取支气管肺泡灌洗液(BALF),进行细胞总数与分类的计数,然后用4%多聚甲醛固定,制成病理切片观察炎症浸润与肺气肿形成情况；取右肺用于提取mRNA和蛋白,用定荧光量PCR和ELISA法检测相关分子的表达和分泌。另一部分小鼠的双肺,剪碎后经胶原酶消化,研磨制成细胞悬液,然后用淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞悬液,经过刺激后以流式细胞术检测肺组织中各个T细胞亚型的变化。脾脏直接研磨后制成细胞悬液经过刺激后以流式细胞术检测肺组织中各个T细胞亚型的变化。结果：烟雾暴露后,PHIL/CS组的炎症浸润程度低于WT/CS组(1.67±0.22vs.2.50±0.29),但尚未达到统计学标准。两者的肺泡内衬间隔(MLI)也无明显差别。WT/CS组和PHIL/CS组BALF中细胞总数均较相应的对照组升高,但是WT/CS组的BALF细胞总数明显高于PHIL/CS组((54.25±2.41)×104/ml vs.(30.22±2.99)×104/ml,P<0.001).除细胞总数以外,WT/CS组的巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量均高于PHIL/CS组(巨噬细胞：(42.47±1.71)×104/ml vs.(25.75±2.39)×104/ml, P<0.001；中性粒细胞：(6.59±1.32)×104/ml vs.(2.34±0.63)×104/ml,P<0.01:淋巴细胞：(5.18±0.65)×104/m1vs.(2.33±0.42)×104/ml, P<0.001).与WT/俐CS组相比,PHIL/CS组肺部Th17与Tc17细胞比例明显降低(Th17:(4.31±0.36)％vs.(8.44±0.56)％, P<0.01； Tcl7:(4.66±0.73)％vs.(10.43±0.51)％, P<0.01).同时,PHIL/CS组脾脏Th17与Tc17细胞比例也低于WT/CS组(Th17:(1.15±0.20)％vs.(2.13±0.31)％, P<0.05:Tcl7:(0.80±0.08)％vs.(1.66±0.34)％, P<0.05).但是,无论是在肺部还是脾脏,WT/CS组和PHIL/CS组Thl和Tc1的比例无明显区别。WT/CS组IL-17A的mRNA水平(9.55vs.4.72倍)和蛋白水平均高于PHIL/CS组(BALF:31.06±4.36vs.16.96±2.18pg/ml,P<0.01；肺组织匀浆：11.11±0.86vs.5.77±1.10pg/mg protein,P<0.001),而两组间IFN-γ的水平相差无几。多种趋化因子(CCL2, CXCL1,CXCL2)及部分炎症因子(IL-6)在WT/CS组的表达水平均高于PHIL/CS组。另有一些趋化因子(CXCL5)和炎症因子(TNF-α和IL-1β)在两组间的表达水平相当。结论：嗜酸性粒细胞缺失能够减轻香烟烟雾暴露诱导的气道炎症,但是不能明显改变肺气肿的形成。嗜酸性粒细胞正向调控Th17/Tc17介导的免疫反应,但是对Th1/Tc1细胞亚群并无明显影响。第三部分嗜酸性粒细胞调控气道炎症及T细胞免疫反应的机制研究目的：从气道上皮细胞和树突状细胞两方面探讨嗜酸性粒细胞缺失减轻炎症以及T细胞免疫反应的可能机制方法：从WT和PHIL小鼠中提取原代气道上皮细胞(MTEC),经气液相培养后,用2%CSE干预,并设立一系列时间点,包括0,3,6,12和24小时。干预完毕后,检测两种小鼠来源的MTEC中各种趋化因子和细胞因子表达水平。仍然利用第一部分所建立的模型,将两种小鼠暴露于烟雾中。暴露时间8周。暴露结束后,取小鼠的肺组织,剪碎后经胶原酶消化,研磨制成细胞悬液,然后用红细胞裂解液去除红细胞,以流式细胞术检测肺组织中DC以及共刺激分子数量和比例。结果：以2%香烟烟雾提取物(CSE)刺激来源于两种小鼠的原代气道上皮细胞,各种因子的表达随着刺激时间的延长呈动态的变化。经过CSE处理后,各种因子在WT来源的MTEC中的表达水平高于PHIL来源的MTEC.其中CXCL2,CCL2,IL-6的表达在两种细胞间相差尤为明显(CXCL2:8.22vs.3.04倍,P<0.05；CCL2:13.06vs.0.60倍,P<0.001:IL-6:7.24vs.0.77倍, P<0.01)。烟雾暴露并未改变肺部DC的比例,但是能显著降低两种小鼠MHC分子的表达(MHC Ⅰ:3.340±0.036vs.2.965±0.027,P<0.001(WT),3.424±0.049vs.3.007±0.012, P<0.001(PHIL)；MHCⅡ:3.395±0.079vs.2.721±0.079,P<0.001(WT),3.432±0.100vs.3.010±0.072,P<0.01(PHIL)).同时,烟雾暴露也使共刺激分子的表达降低,该现象在WT小鼠体内更为明显(CD80:2.881±0.027vs.2.727±0.048,P<0.01:CD86:3.050±0.023vs.2.957±0.015,P<0.05).结论：PHIL小鼠气道上皮细胞对香烟烟雾提取物的反应弱于WT小鼠,嗜酸性粒细胞在该模型中并未影响DC的成熟与活化过程。